Лабораторияда жұмыс iстеудi техника. Қоректендiргiш орталар үшiн жатырлық ерiтiндiлердiң даярлауы. Қоректік орта дайындау

1. 
   Жоғарыда көрсетілгендей қоректік орта мен өсімді материалды стерилдеу.
   
2. 
   Стеррилденген стахис өсінділерін 2-4 смден бірнеше жапырақтары бар бөліктерге бөлу.
   
3. 
   Қатты Мурасиге-Скуга қоректік ортасына Эрленмейер пробиркасына не колбасына отырғызады. Культивирлеудің 1 этабында зақымджанудың алдын алу үшін ортаға антибиотиктер енгізуге болады. Мысалы, канамецин. Антибиотик ерітіндісін алдын ала мембраналы фильтрден өткізіп, 40⁰С температурага дейін салқындатылған ортаға енгізеді.
   
4. 
   Культивирлеу жарықта 20-25⁰С температурада 12 сағат фотопериодта жүргізеді.
   
5. 
   Культивирлеуден 2-3 аптадан соң микроқалемшелер тамырланады және өскін бере бастайды. Алынған өскінді микроқалемшелеу және гормонсыз ортада өсіру арқылы көбейтуге болады.
   

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.

Бақылау сұрақтары :

1. 
   Өсімдікті микроклональды көбейту дегеніміз не? Негізгі этаптары
   
2. 
   Микроклонды көбейтудің негізгі тәсілдері
   
3. 
   Вируссыз отырғызу материалын қалай алуға болады?
   
4. 
   Өз жұмысыңызда вируссыз отырғызу материалын алу үшін кай тәсілді қолданар едіңіз.
   

№ 4 зертханалық жұмыс - Вируссыз отырғызу материалын алу. Картоптың апикальды меристема культурасы

Микроклоналды көбейтуi патогендiк микроорганизмнен сауықтырылған өсiмдiктердi көбейтуi үшiн үлкен мәнге ие. Көптеген микроорганиздер мәдени өсiмдiктердің түсімін жыл сайын жоғалтуына 20% ке жоғалуына әкеп соқтырады.

Бұл аурулармен дәстүрлі химиялық әдістермен күресу мүмкін емес себебі көптеген патогендердің тіршілілік циклі олардың өсімдік-қожайындарының метоболизімен тікелей байланысты. Соңғы кездері сауықтырылған көшет алу үшін апикальды меристеманы тестен өткізу арқылы зерттеу жиі қолданылуда.

( ИФА ) талдауды иммуноферментті талдау әдiсiнiң қағидасы төмендегiдей болады: қарсы геннiң компоненттердiң бiреуiне - қарсы дене ферменттерін қосады, басқа компонент қатты фазаларда сорбциялайды. Содан соны бейтараптау реакцияларын өткiзедi, субстраттарға толықсытады және кешеннiң белсендiлiктерiн анықтайды. Демек, қарсы геннiң пайда болған кешендер санывирустар санына пропорционалды дегенді білдіреді.

Талдау үшiн лункалар қолданылады, онда сүтқоректіден алынған қанға сарысу мен антиденелерді қосады.

Антиденелер төлемнiң ұяшықтарының бетiнде 6 сағат iшiнде сiңiрiп алады. Сарсудың қалдықтары арнайы буферлермен алып тастайды. Содан соң қуыстарда өсiмдiк жапырақтар шырынының зерттелетiн сығындыларын кiргiзедi. Вирус анықталған жағдайда вирус-антидене кешені құрылады. Міндетті түрде бақылау платаларын дайындайды. Буфермен жуғаннан кейін, ұяшықтарға фосфотаза және пероксида ферменттері бар антиденелер қосады. Вирусболған жағдайда антиген-антидене-фермент кешені түзіледі. Егер материал стерилді болса, кешен түзілмейді, фермент қалдықтары буфермен шайылады. Айтылған зерттеулерден кейін плата лункаларына субстрат құяды, Бұл субстратқа фермент ісер етеді.

Реакция нәтижесінде вируспен зақымдалуына байланысты лункадағы ерітінді түсі өзгереді: бояу болмаған жағдайда - вирус жоқ-«-«;ашық қоңыр –«+»-орташа зақымдылған; тым ашық қоңыр-«++» жоғары дәрежелі вируспен зақымдану.

Вирусқа нәтижелі тестілеу жүргізу үшін жоғары сапалы антиденелер, ферменттер, платалар қолдану керек.

Отырғызатывн материал вируспен зақымдалған жағдайда термотерапия немесе химиятерапия әдістерін қолданады.

Термотерапия кезінде бактериальды және саңырауқұлақсыз картоп түйнектерін ИФАдан өткізеді. Кейін оларды трпырақ бар кюветтерге 1-2 аптаға 20-30⁰С температурада,4 апта 37-38 ⁰С 70-80 % ылғалдылықта өсіреді. Күніне 2 рет топырақты ылғалдандырады, 7-10 күн сайын Кноп ерітіндісі мен Мурасиге – Скуг микроэлементтерімен азықтандырады: 5 мл маточный растворға 1 л Кноп ерітіндісі қатысында. Жоғары температураға төзімді түйнек сорттарын бірден 37-38 ⁰С температурада 70 % ылғалдықта өңдейді.

Қыздыру өңдеуi әшекейлi, ұршық тәрiздi, жiп тәрiздi, таяқ тәрiздi вирустермен зақымдалған өсiмдiктерге қолдану тиімсіздеу. Сондықтан қосымша биотехнологиялықтәсілдер қолданылады: апикальды меристема тәсілі. Ол үшін қыздырып өңдеу алдында картоптің жоғары бөлігін кесіп, гетерауксин крітіндісіне 6 сағатқа қояды. Қысқыртылған өскіндерді культуралы камераларға енгізеді немесе 37 ⁰С температуралы бөлме температурасында, топырақ 30-32 ⁰С, 16 сағат фотопериодта 4-6 апта сақтайды.

Қыздыру өңдеуін негізінде күз және қыс айларында өткізеді. Көктемде өсімдіктен 0,3 мм ден 1ммге дейін қолтыө бүршіктерін ажыратады. Жылу режимін әрбір өсімдік түріне эксперимент ретінде алдын ала жүргізіп алады.

Химиятерапия үшін арнайы вирус нигибиторларын пайдаланады: ферменттер, РНК-азалар. Үздіксіз өңдеуді инфильтрация әдісімен де жүргізіге болады, оны вакуумды камерада 20 минут бойына ұстайды.

РНК-азалар өсімдіктің өсуін жылдамдатады. Нәтижесінде қоректік ортада меристема өсуін 30-35% ке дейін жоғарлатады. 30-40% ға дейін регенрант өсімдік өсуі көбейеді