| Материалдар мен құрал-жабдықтар
Картоптың апикальды меристемалары, Мурасиге-Скуг ортасы, Миллер, Уайторталары. БАП, ИУК, кальций гиплохлориті, этил спирті, стерильденген дистильденген су.
Ламинар,термостат, бинокулярлы лупа, пинцет скальпель препоральды инелер, лезвия, петри тостағаншасы,250 мл Эрленмейер колбасы, пробиркалар, мақта, фольга.
Зертханалық жұмыстың орындалу тәртібі
Алдын –ала картоп түйнектерін өсіру.
Картоп түйнектерінен өскіндерін анықтап, 1 мин 70% этил спиртіне салу, содан 15 мин 15% гипохлорит кальций ерітіндісіне салу және 3 рет дистилденген сумен шаю
Ламинар-боксте бинокулярлы лупа көмегімен жоғары бүршіктерден 1 мм болатын меристемаларды анықтау. Ажыратылған меристемаоарды 5 мл сұйық не қатты сахароза мен фитогормонның крнцентрациясы 2 есе азайған Миллер ортасы бар Петри тостағаншасына отырғызу.
Меритеманы бір ай бойы 20-250С температурада 12 сағаттық фотопериодта, 1500 лк жарықта культивирлейді. 3-4 аптадан соң каллус пайда болады.
Каллусты 1-2 мг/л БАП бар Мурасиге-Скуг ортасына көшіру, культивирледің екінші айында12 сағат жарықта интенсивті 5000лк жарықта культивирлейміз.
3 мл ұзындықта қалыптасқан каллусты Уайт ортасына көшіру. 2 аптадан кейін топыраққа отырғызуға болатын өсімдік анықталады.
Зертханалық жұмыстың есеп беру талаптары
Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша көрсетілу керек.
Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет салуға болады.
Бақылау сұрақтары :
Вируссыз отырғызу материалын қалай алуға болады?
Өз жұмысыңызда вируссыз отырғызу материалын алу үшін кай тәсілді қолданар едіңіз.
№ 5 зертханалық жұмыс - Гаплойдты жасушалардың культурасы. Арпа мен сұлының тозаңқаптары мен микроспораларының даму сатыларын анықтау
Жұмыстың мақсаты. Арпа мен сұлының тозаңқаптары мен микроспораларының даму сатыларын анықтау.
Теориялық дәлелдеу.Тозаңқаптарды in vitro өсіргенде, каллус тек микроспоралардан ғана емес, олардың спорогендік ұлпалардың диплойдтық клеткаларынан да түзілуі мүмкін. Сондай каллустардан шыққан регенерант өсімдіктер диплойдтық немесе полиплойдтық болады. Тозаңқаптарды өсіргендегі тағы бәр кемшілік мынау: тозаңқап қабығынан бөлініп қоректік ортаға шығатын заттар жеке тозаңдағы эмбриогенез процессін тежеуі мүмкін. Бұдан басқа, андрогенезге қабілеті жоғары генотиптердің озаңқаптарын қолайлы жағдайда өсіргенде, олар микросполардан жаппай каллустар мен эмбриойдтарды бір мезгілде алуға бөгет болады. Сондықтан жеке бөліп алынған тозаңдарды өсіру тиімді болады. Бірақ, тозаңқапты жарып жіберіп, тозаңды шығарып алу әдісіне тек кейбір тозаңқаптары ірі және тозаңқап ішінде тозаңдары бос жататын өсімдік түрлеріне қолдануға болады.
Бірінші рет 1973 жылы сасық меңдуананың тозаңын өсіріп, оларда эмбриоидогенез процесі жүруін байқаған К.Нич пен Б.Норел болды. Көбіінесе тозаңқапты өсіріп, регенерант өсімдіктеріналу тиімді. Бірақ астық тұқымдастарында тозаңды тозаңқаптан бөліп алу өте қиын. Ол үшін тозаңқаптарды сұйық ортада қалқытып, шайқап өсіру әдісі қолайлы. Тозаңқаптар жарылып ашылады да, тозаң өздігінен шашылып, қалқып ортаның бетіне шығады. Сұйық ортада қалқып жүрген тозаңқаптарды алып тастайды, ал олардан шыққан микроспораларды одан әрі өсіре береді.Тозаңқаптардан биологиялық активтілігі бар заттар шайылып шығып, қоректік ортаның құнарлығы артады, яғни тозаңның өсуіне барынша қолайлы физиологиялық жағдай туады.
Кейбір өсімдіктердің тозаңқаптарын сұйық ортаға саларда оларды өткір скальпельдің ұшымен екіге бөліп жібереді. Ш.Тивари арпамен өткізген тәжірибесінде бүтін тозаңқаптарды сұйық ортада үш тәулік бойы өсіргенде, олардың 60-70% микроспоралары өз бетімен ортаға шыққан. Ал кесілген тозаңқаптарды сұйық ортаға 4 сағат бойы шайқап өсіргенде, олардың 90% микроспоралары сыртқа шыққан. Алдынала тозақаптарды кесіп тіліп сұйық ортада өсірген соң, ортаны сүзіп жіберіп, центрифугадан өткізіп, микросоралары көп фракцияны алған. In vitro жағдайында эксерименттік жолмен гаплойдтарды шығару әдісінің кең таралуына екі ірі кемшілік тегеурін болады:
гаплойдтық өсімдіктердің аз алынуы;
олардың арасында альбиностардың көп кездесуі;
In vitro жағдайында андрогендік гаплойдтарды алу әдістері және осы құбылыстың теориялық негіздері жете зерттелмеген. Осының себебінен гаплойдтық биотехнология жүйесін қалыптастыру талай қиыншылықтарға кездесіп жүр. Микроспораның түрлі даму кезеңдерінде өтетін морфофизиологиялық процестерінің ішкі және сыртқы факторларымен қалай реттелетіні, микроспораның тотипотенттігін жүзеге асыру үшін қандай жағдайлар қажет екені т.с.с. мәселелер әзірше белгісіз болып отыр.Бұл жағдай зерттеушілерді осы маңызды істі эмпирикалық жолмен шешуге мәжбүр етеді, яғни әрбір өсімдіктің түріне, сортына лайық жағдайды тәжірибе арқылы іріктеп алу керек болады.
Андрогенездің тиімділігі (көп гаплоид алу) бірімен бірі өзара байланысты көп факторларға тәуелді: донорлық өсімдіктердің генотипі; олардың өскен жағдайлары; микроспоралардың дамуы кезеңі; эксплантты алдын-ала өңдеу; қоректік ортаның құрамы; гүл тозаңдарын өсіру әдістері, т.б.
In vitro жағдайындағы андрогензді шектейтін негізгі фактор-донорлық өсімдіктің генотипі. Туыстар ішіндегі түрлер тұрмақ, тіпті бір түрге жататын сорттардың регенерацияға қабілеті бірдей болмайды. Мысалы, күріштің жапон түртармағының сорттары тозаңқаптан регенерант өсімдіктерін үнді түртармағымен салыстырғанда артық шығарады. Арпа мен бидайдың көптеген генотиптерінің андрогенездік қабілеті сыналған. Мұндай қабілет арпада 0 мен 31,6 % арасында, бидайда- 0 мен 14,7 % дейін байқалған. Көптеген зерттеулердің нәтижелері көрсеткендей, генотип пен in vitro жағдайында өтетін морфогенездік өзара байланысы өте күрделі, әсіресе бұл даражарнақты өсімдіктерде байқалады. И.Василдің пікірінше экспланттың морфогенезге қабілеті донорлық өсімдіктің генотипіне қарағанда көбінесе оның физиологиялық күйіне байланысты. Тіпті физологиялық күйіне сәйкес өсіру жағдайын жақсартып, генотиптің андрогенезге көрсететін ықпалын төмендетуге болады. Донорлық өсімдіктерді өсіру жағдайы андрогенездің тиімділігіне әсері бар екендігі айқын анықталған. Мысалы егістік жерде өскен өсімдіктердің тозаңқаптары теплицада өскен өсімдіктермен салыстырғанда регенерант өсімдіктерін артық шығара алады. Шамасы, бұл сыртқы факторлардың комплекстік әсерінің нәтижесі болар.
Микроспоралардан каллустар мен эмбриоидтар түзілу жиілігіне донорлық өсімдіктерге ықпал еткен әр түрлі физикалық және химиялық факторлардың әсері көрсетілген. Осы факторлардың ішінде ең мәндісі- температура. Донор өсімдіктерді алдын-ала суықпен өңдеу арқасында эмбриоидтардың түзілу жиілігі артады. Бірақ температура және оның ықпалының ұзақтығы өсімдік түріне, тозаңның даму кезеңіне, оның бөлініп алынған уақытына сәйкес болуы қажет.
Достарыңызбен бөлісу: |
