67
өнімдеріндегі детектрленетін ДНҚ мөлшерін бағалау үшін «шынайы
уақыттағы» ПТР деп аталатын əдіс қолданылады. Бұл детекция
əдісі бойынша амплификация өнімдерінің жинақталу кинетикасын
бақылауға мүмкіндік беретін арнайы реагенттер қолданылады жəне
аспаптармен қамтамасыз етіледі.
«Шынайы» уақыттағы ПТР-ды іске асырудың бірнеше
нұсқаулары бар, олардың біреуі келесідей жүргізіледі. Реакциялық
қоспаға өз құрамында ерекше нуклеотидтер реактивтерімен
таңбаланған, тек бос күйінде сəулелеуге қабілетті гибридиза-
циялы зондтар енгізеді. Күйдіру кезеңінде ампликондардың
ішкі бөліктерімен зондтар гибридизацияланады. ДНҚ синтез-
деу процесінде Taq-полимераза зондтарды өзінің экзонуклеазды
белсенділігімен (активтілік) бұзады, нəтижесінде таңбаланған ну-
клеотидтер ерітіндіге түседі жəне ол жерде олар сəуле шаша (флу-
оресцирлей) бастайды. On-line режимінде арнайы детектормен
тіркелетін флуорисценция қарқыны амплификация өнімдерінің
санына сəйкес келеді. Керісінше, егер гибридтеу жүрмесе, зонд
бүтін болып қалады жəне оның құрамына кіретін нуклеотидтер
сəуле шашпайды (флуоресцирлемейді).
Үлгілерді зерттеу барысында тəжірибенің əрбір сериясында ампли-
фикацияны бақылайды (бірнеше 10-рет ДНҚ-ны қозғайды). Зерттел-
ген үлгі жəне бақылау пробиркаларының реакциялық қоспаларында
бос нуклеотидтердің түзілу кинетикасын салыстыру арқылы ДНҚ-ның
бақылау препараттарын зерттеу үлгісінде жəне диапозонында ДНҚ
концентрациясының жартылай санын бағалауға мүмкіндік туады.
2.3.3. ПТР-зертханаларын ұйымдастыру
ПТР-технологиясы диагностикасының сезімталдығы өте
жоғары болғандықтан, ПТР-зертханаларын ерекше жетік
құрылғыларымен қамтамасыз ету қажет. Бұл əдістің күрделі про-
блемасы, реакция қоспасы сыртқы ортаның спецификалық ДНҚ-
мен контаминациялануы мүмкін, нəтижесінде дұрыстығы жалған
нəтижелер пайда болады.
ДНҚ-ның спецификалық молекулалары амплификация реак-
циясының нысанасы қызметін атқаруы мүмкін, сыртқы ортаға сы-
нама дайындалатын үлгіден немесе амплификация аяқталған про-
биркадан түсуі мүмкін. ПТР-зертханаларын жеткілікті деңгейде
ойластырмаған жағдайда, сыртқы ортаның ДНҚ-нысаналармен кон-
68
таминациялану ықтималдығы жəне реакция қоспасының тұрақты
түрде ластану ықтималдығы өте жоғары.
Контаминациямен күресудің бірнеше əдістері бар, олардың
ішіндегі ең жақсысы – ПТР-зертханаларын дұрыс ұйымдастыру
жəне оның жұмыс істеу режимі.
Технологиялық операциялар саны бойынша ПТР-зертханалар
үш зонаға бөлінуі тиіс (
8-сурет). Барлық үш зона оқшауланған
бөлме түрінде, предбоксниктермен жабдықталуы тиіс. Ауаны
сүзу құрылғысының болғаны тиіс. Егер бірінші жəне екінші зо-
наны қосуға рұқсат етілсе (арнайы бокстар болған жағдайда),
детекцияға арналған бөлме басқа екі зонадан қашық орналасуы
тиіс (басқа қабат, басқа ғимарат) жəне олармен байланысқан жел-
дету жүйесі болмауы тиіс. Бұл ПТР-ды ұйымдастыру барысындағы
қатаң талаптардың бірі.
8-сурет. ПТР-зертханасындағы бағыттардың сызбасы
Бұдан басқа, сыртқы киімді ауыстыру жəне сақтау бөлмелері,
тамақтану, зертханалық материалдарға арналған қойма орын-
дарына арнайы бөлмелер қарастырған жөн. Барлық өндірістік
бөлмелер қысқа толқынды ультракүлгін шамдармен жабдықталуы
тиіс.
Пробиркалар, штативтер жəне басқаларды ауыстыру тек бір
бағытта жүруі тиіс, ағындар бір-бірімен қиылыспауы тиіс. Зертханаға
түскен, зерттелетін материал дереу жағдайда сынама дайындалатын
бөлмеде өңделуі тиіс. Осы бөлмеге «таза зонадан» алынған реакция
қоспасының пробиркаларын алып бару қажет, оларға ДНҚ препа-
раттары салынады. Содан кейін пробиркаларды амплификаторға
салады жəне термоциклдеудің аяқталуына қарай, қақпағын ашпай,
детекцияға арналған бөлмеге алып барады. Барлық операцияларды
ɊȿȺɄɐɂəɅɕԔ
ԔɈɋɉȺɅȺɊȾɕ
ȾȺɃɕɇȾȺɍ ɁɈɇȺɋɕ
ɋɕɇȺɆȺ
ȾȺɃɕɇȾȺɃɌɕɇ ɁɈɇȺ
ȾȿɌȿɄɐɂə ȻԦɅɆȿɋȱ
69
(реакция қоспасын дайындау, сынаманы дайындау, детекция) əртүрлі
адамдар орындауы тиіс.
Реакциялық қоспаны электр розеткасымен, күндізгі жəне
ультракүлгін жарық шамдарымен жабдықталған ПТР-бокста дайын-
дау қажет. Клиникалық үлгілерді өңдеу үшін жұқпалы материалмен
жұмыс істеу барысында қызметкерлердің қауіпсіздігін сақтау үшін
ауаның вертикальды ағынын қамтамасыз ететін жəне ламинарсыз
ағынмен жұмыс істеу мүмкіндігін жəне ішкі қабаттарды ультракүлгін
жарықпен сəулелеудің ұзақ экспозициясын қарастыратын ламинар-
лы сөрелер орнатылуы тиіс.
Биологиялық материалды 1,5 атм. қысымда 1 сағат бойы автоклав-
та инактивациялайды. Үстелге қоятын автоклавтар да қолданылады.
Оң бақылау немесе клиникалық үлгілері бар пробиркаларды өңдеуге
дейін жəне өңдеуден кейін реакциялық қоспаны («таза зона») дай-
ындау бөлмесіне кіргізуге тыйым салынады.
Қолданылған іс-шараларға қарамастан контиминация іздері та-
былса, бөлменің іші, жабдық, тамызғыштар, ыдыстар жəне тағы
басқа заттарды 0,1-молярлы тұз қышқылы ерітіндісімен өңдеу қажет,
ал қолданылған реагенттер порцияларын жаңа түрлерімен ауыстыру
қажет.
Бақылау сұрақтары жəне тапсырмалары
1. Өнімге түсу тəсіліне байланысты тағамның химиялық затта-
рын қалай жіктеуге болады ?
2. Тағам өнімдерінің макро- жəне микронутриенттері қандай
жағдайда потенциалды қауіпті болады?
3. Сізге тағамның қандай балластты заттары белгілі? Адам
тамақтануында балластты компоненттер қандай рөол атқарады?
4. Əлеуметтік токсиканттардың адам ағзасына əсерін қысқаша
сипаттаңыз.
5. Адам денсаулығына биогенді аминдер қандай қауіп төндіреді?
Мысалдар келтіріңіз.
6. «Антиалиментарлы заттар» түсінігіне анықтама беріңіз. Анти-
алиментарлы заттардың негізгі топтарын атап шығыңыз, олардың
адам ағзасына əсерін сипаттаңыз.
7. Табиғи текті қандай уытты заттар тағам өнімдерінде кездесуі
мүмкін? Тағам өнімдеріне табиғи токсиндердің түсу қаупін жою
жəне азайту үшін қандай алдын алу іс-шараларын жүргізуге болады?
Достарыңызбен бөлісу: |
