62
1- кезең
Денатурация (93-95
0
С)
2- кезең
Праймерлерді күйдіру (50-65
0
С)
ДНҚ- ның ізделіп отырған фрагменттері
3- кезең
ДНҚ тізбегінің синтезі
(72
0
С)
4-сурет. Амплификация циклі
ДНҚ-ның ізделіп отырған фрагментінің көшірмесін жеткілікті
мөлшерде алу үшін амплификацияның 20-40 циклін жүргізеді.
Амплификацияның бірінші циклінде түзілген ДНҚ-ның жаңа тізбектері
екінші цикл үшін матрица қызметін атқарады, екінші циклде де ампли-
кон деп аталатын ізделіп отырған ДНҚ-ның спецификалық фрагменті
түзіледі. Амплификацияның келесі циклдерінде ампликондар жаңа
тізбектерді синтездеу үшін матрица қызметін атқарады (
5-сурет).
63
Осылайша, ерітіндідегі ампликондардың жинақталуы 2
n
формула-
сы бойынша жүреді, мұндағы, n – амплификация циклдерінің саны.
Сондықтан егер бастапқы ерітіндіде тек бір екітізбекті ДНҚ молеку-
ласы болса, 35 цикл ішінде ерітіндіде теориялық түрде ампликонның
30 млрд-тан астам молекуласы жинақталуы тиіс. Агарозды гельде
фрагментті электрофорез əдісімен визуалды түрде анықтау үшін осы
мөлшер жеткілікті болады.
Шын мəнінде, амплификацияның жекелеген циклдерінің
тиімділігі кейбір мəліметтер бойынша 78-97% құрайды. Сынамада
реакция ингибиторлары болса, бұл мəн едəуір төмен болуы мүмкін,
амплификацияның спецификалық өнімдерінің шынайы санын:
А = М(1+Е)
п
,
теңдеуі бойынша дəлірек анықтауға болады.
Мұндағы,
М – ДНҚ-нысаналарының бастапқы мөлшері; n –ам-
плификация циклдерінің мөлшері;
Е – реакция тиімділігі.
ДНҚ-ның
ізделіп отырған бөлімі
5-сурет. Амплификация өнімдерінің экспоненциалды
түрде жинақталуы
Амплификация процесінде, бастапқы тізбектегі ұзын фрагмент-
тер де синтезделеді, бірақ олардың жинақталуы тек арифметикалық
прогрессияда:
64
К=Мп
формуласымен жүреді
Мұндағы,
К-амплификацияның ұзын өнімдерінің саны; п-циклдер
саны.
Осылайша, соңы праймерлермен шектелген спецификалық фраг-
менттер алғаш рет екінші цикл соңында пайда болады, геометриялық
прогрессияда жинақталады жəне кейінірек амплификация өнімдері
арасында басымдықты иеленеді.
Амплификация өнімдерін детектрлеу. Бұл кезеңде идентифи-
кациялау мақсатында ПТР өнімдерінің қоспаларына талдау жасала-
ды. Əртүрлі əдістер қолданылады, соның ішінде:
- агарозды гельдегі горизонтальды электрофорездің классикалық
əдісі;
- полиакриламидті гелдегі вертикальды электрофорез əдісі;
- гибридизациялы зондтар əдісі;
- «шынайы уақыттағы» ПТР
Фрагмент өлшемі
«Кішкене басқыш» ПТР фрагменттері
6-сурет. Агарозды гельдегі ПТР өнімдерінің
электрофоретикалық бөлінуі
Агарозды гельдегі горизонтальды электрофорез əдісі.
Қазіргі уақытта ДНҚ молекуласын өлшемі бойынша бөлуге
негізделген электрофорез əдісі кеңінен таралған. Бұл үшін ага-
розды гель пластинасын дайындайды, ол электрофорездік буфер-
65
де ДНҚ-ның арнайы бояуышы қосылған ерігеннен кейін қатып
қалған агароздан тұрады, оларға мысалы, ДНҚ-ның арнайы бо-
яуышына екітізбекті ДНҚ фрагменттерімен төзімді қосылыстар
түзетін бромды этидия жатады.
Гельге құю кезінде тарақтар көмегімен арнайы шұңқырлар
қалыптастырады, кейін бұл шұңқырларға амплификация өнімдері
салынады. Гель пластинасын горизонтальды гель-электрофорезге
арналған аппаратқа салады жəне тұрақты кернеу көзіне қосады.
Теріс зарядталған ДНҚ гельде «минустан» «плюсқа» қарай қозғала
бастайды. ДНҚ-ның өте қысқа молекулалары ұзын молекулаларға
қарағанда, жылдам қозғалады, ал бір өлшемдегі молекулалар
бірдей жылдамдықпен қозғалады. Гельдегі ДНҚ-ның қозғалу
жылдамдығына агароз концентрациясы, электр өрісінің кернеулігі,
температура, электрофорездік буфер жəне аз деңгейде ДНҚ құрамы
əсер етеді.
10 минуттан 1 сағатқа дейін созылатын электрофорез
аяқталғаннан кейін гельді ультракүлгін диапозонда (254-310 нм)
жарық шығаратын трансиллюминатор фильтріне салады. ДНҚ
жұтатын ультракүлгін энергиясы 260 нм аймағында бояуыш мо-
лекуласына беріледі, ДНҚ жұтатын ультракүлгін энергиясы бо-
яуыш молекулаларын көрінетін спектрдің қызғылт-қызыл облы-
сында сəуле шашуға (флуорисцерлеу) мəжбүрлейді, бұл, агарозды
гельде амплификациялық қоспаны электрофоретикалық түрде
бөлгеннен кейін, оларды жарқыраған жолақтар ретінде тіркеуге
мүмкіндік береді (
6-сурет).
Вертикальды электрофорез əдісі. Горизонтальды электрофо-
рез əдісінен айырмашылығы агароз орнына полиакриламидті гель
қолданылады, ал амплификация өнімдерін бөлуді вертикальды элек-
трофорезге арналған арнайы камерада жүргізеді.
Полиакриламидті гельдегі электрофорез агарозды электрофо-
резден айырмашылығы үлкен шешуші қабілетке ие, яғни əртүрлі
өлшемдегі ДНҚ молекуласын бір нуклеотидке дейін дəлдікпен
ажыратуға мүмкіндік береді.
66
ДНҚ мөлшері
(10
-15
мольдер)
Электрофорез
Иммуноферменттік детекциясы бар
гидризациялы зондтар əдісі
7-сурет. Детекция əдісінің салыстырмалы сезімталдығы
Гибридизациялы зондтар əдісі. Детектрлеудің электрофорети-
калық əдісінің бірқатар кемшіліктері бар, жекелеп айтқанда
сезімталдығы төмен, нəтижелерді есептеуде субьективті, бір
ампликондағы əртүрлі ДНҚ-дарды анықтауы шектелген. Бала-
ма ретінде детекцияның гибридизациялы сызбалары ұсынылған.
Бұл сызбаларда амплификация нəтижесінде пайда болған ДНҚ
фрагменттері спецификалық олигонуклеотидті зондтармен
гибридтеледі (екітізбекті кешендер – «гибридтерді» түзеді). Мұндай
кешендерді тіркеу колориметриялық немесе флуориметриялық
əдіспен жүргізілген. Тəжірибеде жиірек иммуноферменттік анализ-
де қолданылатын түріне ұқсас микропланшеттік формат жəне детек-
ция жүйесін қолданады. Детекцияның иммуноферменттік жүйесі
бар гибридизациялы зондтар əдісінің сезімталдығы горизонтальды
электрофорез əдісінің сезімталдығынан шамамен алғанда, 100 есе
асып түседі (
7-сурет).
Массалық скрининг тұрғысынан алғанда гибридизациялық
əдістер үлкен қызығушылық тудырады, себебі қажетті жабдықтар
болған жағдайда оңай автоматтандырылуы мүмкін.
«
Шынайы уақыттағы» ПТР. Соңғы уақытта амплификация
Достарыңызбен бөлісу: |
