8.1.3. Модификации трифосфатной группировки
Синтезированы 2'-дезоксинуклеозид-5'-(α-тио)-трифосфаты и их 3'-замещенные аналоги – dTTP(3'N3)(α-S), dTTP(3'NH2)(α-S), dTTP(3'F)(α-S). Все три являлись терминаторными субстратами обратной транскриптазы, но не узнавались ДНК-полимеразой α. ДНК-полимераза β и ДНК-полимераза I E. coli утилизировали только dTTP(3'NH2)(α-S), dTTP(3'F)(α-S).
Изостерные фосфонатные аналоги 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидроаденозина и 3'-дезокси-2',3'-дидегидротимидина и их β/γ -замещенные производные терминируют синтез вирусной ДНК, проявляют субстратные свойства по отношению к ревертазе ВИЧ, оказывая весьма незначительное воздействие на другие клеточные ДНК-полимеразы.
Перечисленный выше набор ингибиторов позволяет исследователям в области репликации выключать отдельные стадии репликации in vitro, подавлять действие одних типов полимераз при сохранении активности других). Без использования таких соединений в настоящее время изучение репликации в бесклеточных системах представляется невозможным. Особый интерес представляют селективные ингибиторы. Так, ddNTP не действуют на активность ДНК-полимеразы α, тогда как araNTP ее ингибирует. Азидо-NTP избирательно действует на ревертазу.
Однако при переходе к более сложным системам (хроматин, ядра, клетки) появляются новые проблемы, связанные с транспортом соединений через клеточные стенки, метаболизмом, с особенностями взаимодействия ингибиторов с более сложными комплексами, обеспечивающими процесс биосинтеза ДНК в клетках.
8.2. Субстратоподобные ингибиторы in vivo
Применение субстратоподобных ингибиторов in vivo осложняется выбором такой формы ингибитора, которая проникала бы в клетки через клеточные мембраны. Фосфорилированные формы субстратов через клеточные стенки, как правило, не проходят, поэтому обычно используются нуклеозиды. Определение молекулярного механизма действия соединений нуклеозидного характера весьма сложно. Это связано с тем, что модифицированные нуклеозиды подвергаются многим ферментативным воздействиям, среди которых одни ведут к биологически активным формам (например, к трифосфатам нуклеозидов), другие, напротив, инактивируют исходные соединения. Образующиеся в процессе метаболических изменений разные производные могут иметь свои мишени. Поэтому многие молекулярные механизмы не выяснены. Кроме того, ингибиторные эффекты и механизмы действия одного и того же типа ингибиторов сильно различаются в различных клетках, а также в одних и тех же клетках, но инфицированных разными фагами вирусами. Это связано, как правило, с особенностями метаболизма клеток, а также с изменением пула и активности ферментов при инфицировании клеток или вирусами. В клетках прокариот положение осложняется существованием многих мутантных форм и различным их отношением к ингибиторам.
Уже много лет в качестве ингибиторов применяются арабинозилнуклеозиды (araN) (рис. 8.9), среди которых наиболее активен araC. У него есть по крайней мере несколько мишеней действия на репликацию. AraC в первую очередь ингибирует инициацию новых репликонов, тогда как уже инициированные репликоны продолжают реплицироваться. Лишь при более высокой концентрации araC наступает полное ингибирование всех стадий процесса репликации. В клетках araC трифосфорилируется и включается в цепь ДНК.
Известно, что в отдельных случаях ингибиторами синтеза проявляют себя ДНК ddN. Однако применение ddN in vivo резко ограничено низкой эффективностью его фосфорилирования в клетках.
Рис. 8.9. Аналоги нуклеозидов
Также мало изучен в системах in vivo dT(3'F), а другие dN(3'F) (рис. 8.9) in vivo вообще не применялись. Известно, что dT(3'F) ингибирует биосинтез ДНК и включается во внутренние положения цепи ДНК.
Вследствие большего подобия природным дезоксинуклеозидам, dN(3'NH2) эффективно фосфорилируются в различных клетках и активно включаются в метаболизм, в том числе и в синтез ДНК. Так, dT(3'NH2) эффективно ингибировал рост и размножение ряда клеток млекопитающих в культурах, а также репродукцию вируса простого герпеса I типа в клетках. Также активен был и dC(3'NH2). Все четыре dN(3'NH2) эффективно ингибировали репликацию ДНК в эмбрионах морских ежей, что объясняется высокой активностью нуклеозид- и нуклеотидкиназ в этих клетках.
Азидотимидин (3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин) эффективно подавляет репродукцию ВИЧ, мишенью действия является ревертаза. Этот препарат широко используется при лечении СПИДа, но требуются высокие концентрации, что связано с низкой эффективностью его фосфорилирования в клетках.
Ацикловир и ацикло-G (рис. 8.9) оказались очень сильными ингибиторами репликации вирусов герпеса простого I и II типов in vivo. Оба препарата трифосфорилируются в клетках тимидинкиназами, кодируемыми этими вирусами, и ингибируют элонгацию цепей ДНК.
Мощным ингибитором для клеток млекопитающих in vivo оказался C(2'N3). Главной мишенью его действия является инициация репликации – инициация репликона. Часть C(2'N3) трифосфорилируется в клетке и ингибирует инициацию фрагментов Оказаки.
5'-Аминодезоксинуклеозиды dN(5'NH2) ингибируют биосинтез ДНК в клетках эмбрионов морского ежа, влияя на активность тимидинкиназы.
Ингибиторами биосинтеза нуклеиновых кислот in vivo являются производные пуриновых и пиримидиновых компонентов РНК, отличающиеся от них или заместителями в гетероцикле, например 9-β-D-рибофуранозил-пурин (небулярин), или гетероциклическими основаниями, отличными от оснований в нуклеиновых кислотах
Изостерные фосфонатные аналоги нуклеотидов обладают антивирусной активностью, и некоторые из них являются селективными ингибиторами синтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ. АнтиВИЧ активность фосфонатных аналогов нуклеотидов обусловлена способностью обратной транскриптазы ВИЧ селективно узнавать их дифосфатные производные в качестве субстратов, после чего эти производные терминируют синтез вирусной ДНК.
Достарыңызбен бөлісу: |
