Механизм РНК-интерференции
Процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer, который разрезает длинные молекулы дцРНК на короткие фрагменты порядка 21-25 нуклеотидов с неспаренными основаниями на каждом конце – малые интерферирующие РНК. МикроРНК также образуется из предшественника при разрезании его белком Dicer, кроме того, процессинг предшественника микроРНК может также осуществляться с помощью другого белка (Argonaute 2). Инициатор сайленсинга Dicer имеет хеликазный домен, С-концевой сегмент связывания с РНК и домен РНКазы III.
Далее дуплексы siRNA поступают в комплекс RISC (RNA-induced silencing complex). RISC – мультибелковый комплекс ~500 kD, состоящий из нуклеиновых кислот и белков. В каталитическом RISC-комплексе при участии белка Argonaute-2 происходит расплетение дуплекса siRNA и связывание короткой одноцепочечной РНК со специфической последовательностью в кодирующей области мРНК. Лишь одна из двух цепочек siRNA, называемая ведущей (guide strand), вызывает сайленсинг гена. Другая, называемая цепочкой-спутницей (passenger strand, anti-guide strand), подвергается деградации во время активации RISC.
RISC осуществляет разрезание комплементарных одноцепочечных мРНК в месте узнавания, что предотвращает трансляцию этих РНК. РНК разрезается в середине места узнавания, примерно 12 п.н. от 3' конца siRNA (рис. 9.6). Либо же происходит ингибирование трансляции и/или деаденилирование мРНК. Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК – siRNA и микроРНК.
У растений, грибов и нематод в процесс подавления экспрессии генов вовлечены РНК-зависимые РНК-полимеразы, которые используют siRNA в качестве затравок для синтеза новой РНК. Образовавшаяся дцРНК разрезается на части ферментом Dicer, образуются новые siRNA, которые являются вторичными. Таким образом, происходит усиление сигнала.
Рис. 9.6. Механизм РНК-интерференции.
Биологические функции РНК-интерференции связывают с защитой клетки от вирусов, репрессией трансгенов, регуляцией некоторых генов. Важная функция siRNA – контроль активности мобильных генетических элементов (транспозонов). Известным феноменом у растений является RNAi-зависимое метилирование ДНК. Система РНК-интерференции у эукариот может использоваться для поддержания структуры хроматина. У многих организмов, в том числе и у человека, микроРНК принимают участие в образовании опухолей и нарушении регуляции клеточного цикла. В данном случае микроРНК могут являться как онкогенами, так и супрессорами опухолей. Важное значение эндогенно экспрессируемые микроРНК имеют при репрессии трансляции на некоторых этапах развития живых организмов, особенно на стадии морфогенеза и поддержания клеток в недифференцированном состоянии (например, в случае стволовых клеток).
Уже сразу после открытия РНК-интерференция стала использоваться как мощный и удобный способ специфического подавления экспрессии генов, исходя из их нуклеотидной последовательности, в том числе для массового скрининга генов. Систему РНК-интерференции часто применяют в экспериментальной биологии для изучения функции различных генов в культурах клеток и в модельных организмах in vivo. Одним из основных инструментов, применяемых генетиками для решения этого вопроса, является "выключение" гена. В биотехнологии РНК-интерференция используется, в частности, для создания растений, синтезирующих натуральные токсичные вещества в более низких количествах. Большие перспективы имеет применение методов РНК-интерференции в терапии. RNAi может быть использована для лечения рака. Для этого можно создать нокдаун генов, ответственных за клеточный цикл, и противоапоптозных генов в клетках опухоли. Если доставить siRNA, обладающую способностью связываться с каким-либо участком генома ВИЧ, который состоит из РНК, можно попытаться не допустить его встраивания в ДНК клетки хозяина.
Достарыңызбен бөлісу: |
