Дипломдық ЖҰмыс төменгі сатыдағЫ Өсімдіктердің техногенді ластанған топырақТЫҢ биологиялық белсенділігіне әсері

Материалдар және құрылғылар. Заттық және жабындық шынылар, микробиологиялық ілмектер, спирт жандырғышы, препараттар үшін кристаллизатор, суы бар жуғыш, фильтр қағазының жолақтары, микроскоп, қара тушь, циль карболды фуксині, дестильденген су, 1% -ті кристаллвиолет сулы ерітіндісі, 2%-тік мыс купоросы ерітіндісі, 40%-ті формамен ерітіндісі, шыны кесінділері бар Петри шынысы, Никифоров қоспасы, жинақтауыш және адамға пайдасы бар бактериялар. Жұмыс тәртібі

9. 
   Грамм әдісі бойынша бактерияларды бояу
   

Бактериялардың Грамм бойынша бояуға әсерін, түрлерді анықтауда диагностикалық белгілердің бірі ретінде қолданады. Әдіс, бактериялардың кейбір түрлерінің жасушада негізгі бояғыштар-геницианвиолет және кристаллвиолеттің иодпен берік қосылыстар түзу қабілетіне негізделген. Бактериялардың бұл формалары, оларды одан ары 95%-ті этинол немесе ацетонмен өңдегенде, өзінің күлгін бояуын сақтайды және грамм-оң деп аталады. Бұлардан өзгешелігі, бактерияның басқа формалары иодпен берік қосылыстар түзбейді, оларды 95%-ті этинолда немесе ацетонда өңдесе, оңай түссізденеді және қосымша бояғыштарға ие және оларды грамм-теріс деп атайды.

Микроағзалардың Грамм әдісі бойынша бояуға қатынасын анықтау үшін, жас, тәуліктік бактерияларды қолданған дұрыс. Әйтпесе, ескі немесе өлуге жақын микроағзалар Грамм әдісі бойынша біркелкі боялмайды. Шыныға жағылған жағындылар, мүмкіндігінше жұқа және біркелкі болулары тиіс. Егер қалың етіп жағылса, оны дифференциациялау қиын болады да, грамм-терісті формалар, грамм оң бактериялар тәрізді көрінуі мүмкін.

Материалдар және құрылғылар. Заттық шынылар, микробиология-лық ілмек, спиртті жандырғыш, препараттар үшін тіреулі кристаллизатор, суы бар жуғыш, микроскоп, 1%-ті геницианвиолет немесе кристаллвиолеттің сулы ерітіндісі, Люголь ерітіндісі 300 мл дистилденген суда ерітілген 1г І₂ + 2 = KІ, 95%-ті этанол немесе ацетон, 0,1%-ті фуксин ерітіндісі, микроорганизмнің тәуліктік таза түрлері.

Жұмыс тәртібі: Грамм бойынша бактериялардың боялуының дұрыстығын тексеру мақсатында, бояуда заттық шынының ортасына тамызады және одан ары бірден үш жағындыны өңдейді. Грамм-оң бактерия түрі, грамм-теріс бактерия және олардың арасына зерттелетін микроағзалар жағындысын жағады.

Жағындыны ауада кептіреді, жанарғының жалынында белгілейді және 1%-ті геницианвиолет немесе кристаллвиолеттің сулы ерітіндісімен 1-2 минут шаяды. Препаратты сумен жуады және ыдыста 95%-ті этанол немесе ацетонмен 15-30-60 секунд араластырады. Ацетон өте тез, ал 95%-ті этанол анағұрлым баяу әсер ететіндігін ескеру қажет. Жағындыны дифференциациялауды, препараттан бояғышты жууды аяқтағанда тоқтатады. Жағындыны дифференциациялап болған соң, препаратты тез сумен мұқият жуады және қосымша бояғыш 1%-ті фуксин ерітіндісімен 2-3 минут бояйды. Препаратты біржолата, соңғы рет сумен жуып, ауада кептіреді және МИ-90 объективін қолданып микроскоппен қарайды.

Препаратта грамм оң бактериялар көк-күлгін түске, грамм теріс қызғылт-малина түске боялады.[22]

Зерттеу тәсілдері.

Лабораториялық жағдайда топырақ микроағзаларын зерттеу үшін әртүрлі әдістерді қолданады. Олардың әрқайсысының өзіндік артықшылығы мен кемшіліктері болады. Топырақтағы микробтар ұрықтарының санын дәлдеп, анықтау үшін микроскоптық жолмен жасушаларды бірден санау әдісімен қолданған жөн. Әрине техникалық жағынан алғанда бұл әдіс едәуір қиындық келтіреді, сондықтан зерттеушіден үлкен шеберлікті біргірлікті талап етеді. Микробтар ұрықтарын санау үшін препаратты бекітеді (фиксациялау) және бояйды. Әрине, бұл тірі жасушаларды есептеуге мүмкіндік бермейді. Топырақ суспензиясын сұйық қоректік ортаға сепкенде өсіп шығатын микробтар ұрықтары жоғарыда көрсетілген әдіске қарағанда аз болады. Бірақ бұл өте қарапайым және қолайлы әдіс болып саналады.

Топырақ микроағзаларын есептеуге қоректік пластинкалар әдісін пайдаланады. Бұл әдіс микробтардың тірі ұрығын бақылап, олардың сапалық құрамын анықтап, культураларды таза күйінде оларды бөліп алуға көмектеседі. Бұл әдіспен сұйық ортада шектеп сұйылтуға қарағанда микробтар ұрықтарын көбірек табуға мүмкіндік береді.

Физиологиялық топтарымен зерттеу әдістерін ескере отырып, микроағзалардың әрбір топтарына өзінше қажетті қоректік орталарда дайындайды. Топырақтың зерттеуге арналған орта үлгісін жеке үлгілерді қоса отырып дайындайды.

Н.А.Красильников (1966) 100см² алаңнан үш, ал 100м²-ден көбірек болғанда бес жерден, гектар және одан да көбірек алаңнан 15 үлгі алуға болады деп көрсетеді. Мәселен, жыртылып жүрген топырақтан барлық жырту тереңдігінен алады. Бұнда тек топырақтың генетикалық горизонты бойынша зерттелегенде оның бетінің 2 сантиметрлік жоғары алып тастау керек. Топырақ үлгісін алу үшін күрек, метал қалақ, пышақ кейде топырақ бұрғысын пайдаланады. Бұл заттардың барлығы топырақ үлгісін олардан бұрын жақсылап тазартылуы керек, олар спиртке ылғалданған мақтамен сүртіліп, артынан жалында жақсылап қыздырылуы тиіс.

Топырақ үлгілері зарарсыздандырылған прогменттен жасалған дорбалар немесе мақта дәкеге тығындары бар шыны банкілерге салынады. Топырақ үлгісін олар алар алдында зарарсыздандырылған пышақпен оның 2 сантиметрлік қабатын қырып алып тастайды. Одан соң қалақ немесе күрекшемен 600-200г топырақты алып қалташа немесе банкіге салады. Микроағзаларды топырақтың барлық тереңдігінен зерттегенде, оның әрбір горизонтынан жеке үлгілер бөлініп алынады. Бұл үшін едәуір көлемде шұңқыр қазылады да, ондағы топырақ горизонттарын белгілеп алып, әрбірекінен жеке үлгіні жинайды. Үлгісі бар қалташаларды нөмірлейді, горизонтқа байланысты сорттайды, одан соң лабораторияға жөнелтеді. Топырақ үлгісі сол күні лезде анализденбесе, қолайлысы оны 30⁰ С құрғатып алып, сақтап қоюға болады. Бірақта құрғатылған топырақта микроағзалардың әртүрлі физиологиялық топтарының өзара қатынасы күрт өзгереді.

Топырақтың даяр үлгісіне микробиологиялық жолмен зерттегенде бірден оның ылғалдығын тексеруге арнап 5-10г және рН дәрежесіне анықтауға арнап бір үлгі алады. Микробиологиялық анализ жасау ерекше ұқыптылықты және жұмыста дәлдікті, айқындықты талап етеді.

Топырақтағы бактериялар, саңырауқұлақтар және актиномицеттердің санын анықтаудың ең қарапайым әдісін Д.М.Новогрудский ұсынған болатын. Бұл әдіс бойынша майдаланған топырақты агарланған суда себеді. Алдын ала Петри табақшасына агарланған суды құйып, қатырады да, оның бетіне топырақ бөлшектерін орналастырады. Сонда топырақ бөліктерінің айналасында жарғақшалар пайда болады, онда микроағзалар өседі. Бұл орта қоректік заттарға өте кедей, сондықтан микроағзалар топырақ түйіршектерінің айналасында ғана орналасады. Саңырауқұлақтар алғашқы күндері топырақ түйірінің айналасынан ғана көрінсе, кейін бүкіл Петри табақшасына қаптайды. Топырақ түйіршіктерінің айналасында микроағзалардың бірнеше жасушалары өсетіндіктен жалпы топырақтың микроағзаларға қандай дәрежеде бай екенін айыру қиын. Ал Д.М.Новогрудскийдің әдісі тым қарапайым және оңай атқарылатын болғандықтан, топырақтағы микроағзалардың кездесуі жөнінен жалпы мағлұмат алуға болады.

Петри табақшасына ішінде майда құрғақ топырағы бар төменгі жағы елекпен жабдықталған ыдыспен себеді. Топырақты елекке салар алдынан және оны агар бетіне сеуіп болғаннан соң қалғаннын өлшейді. Осы екі өлшемнің айырмашылығына қарап себілген топырақ салмағын шығарады. Әр табақшаға 50-200мг шайда топырақ себеді. Әр топырақ түріне кем дегенде үш Петри табақшасын арнайды. Саңырауқұлақтарды үлгі себілгеннен соң 1-2 күннен кейін санайды, бактерияларды 3-5 күн, актиномицеттерді 15-20 күннен соң тексереді. Жалпы тексеру үшін топырақ үлгісі себілген агар пластинкасын бірнеше бөліктерге бөліп, микроскоппен тікелей қарап санайды.

2.2.10. Жасанды қоректік ортаға себу әдісімен топырақтағы

микроағзалар санын анықтау

Топырақ суспензиясын дайындау. Бұл үшін ішінде зарарсыздандырылған 3 мл суы бар бірнеше пробиркаларды, ішінде 90 мл зарарсыздандырылған суы бар колбаны және сыйымдылығы 200 мл болатын зарасыздандырылған, құрғақ екінші колбаны дайындайды.

Зерттелетін топырақты зарарсыздандырылған әйнек бетіне салады. Әйнекті алдын ала спиртпен сүртіп, спиртовка жалынына қарып алады. Топырақты шпатилмен жақсылап араластырады, механикалық қоспалардан тазартады. Зарарсыздандыру ережесін сақтай отырып, әйнек бетіне 15 гр топырақ салады. Одан соң оны зарарсыздандырылған кордон тостағаншаға 10г топырақты өлшеп салады. Бұған алғашқы колбадан зарарсыздандырылған судан 1-2 мл су кұйып, 5 минут езеді. Тостағаншада езілген топырақты, екінші құрғақ колбаға салады. Сонда 1:10-ға тең бірінші сұйылтуды алады. Колбадағы топырақ суспензиясын 5 минут бойына шайқап, 30 минуттай тұндырады да, зарарсыздандырылған суы бар 1-ші пробиркаға құяды. Сонда 1:100 сұйылту алынады. Дәл осылайша бірнеше сұйылтуды – 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:1000000 жүргізеді. Сұйылту дәрежесі топырақтағы микроағзалар санына, топырақтың типіне, генетикалық горизонтқа, жыл маусымына, топырақ үлгісінің ылғалына байланысты болады. Әрбір жаңа сұйылтуды атқару үшін жаңа зарарсыздандырылған пипетканы қолданады. Бактерияларды бөліп алу және санын есептеу үшін әр түрлі сұйылтылған пробиркадағы топырақ суспензиясын ЕПА, КАА (крахмалды амиакты агар) агарлы топырақ Әшби орталығына себеді.

Саңырауқұлақтар мен ашытқыларды бояу және санау үшін СА (суслоагарды) немесе түрлі өзгертілген Чапек ортасын пайдаланады.

Су машинасында балқытылған қоректік ортаны, зарасыздандыру ережесін сақтай отырып, Петри қабықшысына қалыңдығы 0,5-0,8 см етіп құяды. Әрбір сұйылтуға осындай Петри табақшасының 3-5 даярлайды. Орта қатқаннан соң оның жабынынан судың тамшыларын жоғалту үшін Петри табақшасын 60-70⁰ С температурасы бар термостатқа кетіреді. Жабын әйнекке топырақ нөмерін, себу мерзімін, сұйылту дәрежесін және тәжірбиенің қайталпау санын жазып қояды.

Топырақ микроағзаларын бөліп алу үшін, топырақ суспензиясын қоректік ортаның бетіне себеді. Алдымен пипеткамен бір мл сұйылтылған суспензия алынады. Әр сұйылтуды қоректік ортаға енгізген алдында зарарсыздандырылған жаңа пипетка және сипотель алынуы тиіс. Зарарсыздандырылған пипеткамен тиісті сұйылтудан 1мл топырақ суспензиясын алып Петри табақшасындағы қатты қоректік ортаның дәлдеп ортасынан құяды.

Шпательмен осы тамшыны агар бетіне жақсылап жояды. Топырақ суспензиясын себу үшін әдетте 0,1- 0,2 мл микропипеткаларды қолданады. Себілген Петри табақшасын қақпағын төмен қаратып, 28-37⁰С термостатқа иқояды. Петри табақшасындағы бактериялар колониясын 3-5, саңырауқұлақтар мен ашытқыларды 5-7, актиномицеттер 7-15 тәуліктен кейін санайды. Егерде Петри табақшасынан 50-200 колония бактерия мен актиномицеттер, 30-50 колония саңырауқұлақтар табылса, нақты нәтиже деп есептейді.

Петри табақшасындағы колонияларын санау.

Бұл үшін Петри табақшасының табанын тұщы немесе сиямен бір неше сектор немесе сегментке бөледі. Егер де қоректік орта мөлдір болса, колонияларды табақша астынан түзіп тұратын жарық сәулесімен санайды. Саналған колонияларды сиямен нүкте салу арқылы белгілеп қояды. Өте майда колонияларды үлкейтетін шыны – лупамен санайды. Тиісті сұйылтудан себілген Петри табақшасындағы микроағзалар колониясын есептеп, табақшадағы колониялар санының орта көрсеткішін анықтайды да, оны 1г құрғақ топыраққа шағады:

А = (б * в * г) / Д

Бұнда а – 1г құрғақ топырақтағы микроағзалар жасушаларының саны. б – Петри табақшасындағы микроағзалар колониясының орта саны. в – тиісті сұйылту. г – пипеткадағы 1 мл сұйықтағы тамшы саны, д - анализге алынған топырақ салмағы. Осымен қатар бұл анализ кезінде топырақ ылғалдығын анықтайды.[23]

2.2.11. Бактерия штаммын бөліп алу әдісі.
Түп нұсқасына мақта ризосферасынан ажыратылған азотофискация бактериясының штаммы алынған (АБ). Эшби ортасында бөлінген дақыл, мына құрамда (г/л) манит – 20,0: K₂HPO₄-O₂; M₃SO₄x7H₂O-O2 NaCl-02 K₂SO₄ CaCo₃-5,0 агар 20,0. Ол ортаға Федоров әдісімен микроэлемент қоспасын пайдаланған.

Мақта ризософерасынан 10 г таза топырақ алынып, оны таза стерилбденген суға салып (100мл) 1:1000 және 1:10000 пропорциясында сұйылтып петри ыдысына егілді оның ұстінен Эшби қоректік ортасы құйылды. Бактерияларды инкубациялау 3 тәулікке +28 ⁰. термостат ішінде жүргізілді.

Микроорганизмдердің сипатты нитрогеназалық белсенділігін біз Федоров әдісімен анықтадық. 500 мл Эшби ортасына 20г көмір қышқылы бор кальций 1 мл 1% азот қышқылды кальций және 0,5 гр ТТХ-(трефенил-тетразали-хлорид және қызыл метилен индикатор қосылды. Дайындалған ортаға 5 тәулік арасында өскен тест культуралары егіліп, 6 тәулік аралығында бақыланды. Нитрогеназалық белсенділікті біз культуралар колониялардың айналасында қоректік ортаның қызару аймағын өлшеп оның белсенділігін анықтадық.

Бактериялардың морфологиялық белгілерін біз (Аристовская Т.В. Большой практикум по микробиологии., Егорова В.Б. Практикум по микробиологии., Звягинцев Д.Г., Асеева И.В., Бабьева И.П., Мирчинк Т.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии., Теппер Е.З., Шельникова В.К. Практикум по миробиологий) кітаптарда көрсетілген әдістерден пайдаландық.

Бактериялардың капсулаларын бояуда біз Бурри әдісін қолдандық. Жақсы тазаланған зат айнасына 1 тамшы туш тамызылады үстінен өсіп жатқан бактерия сұйықтығын 1 тамшы тамызып оны шыны айнасы мен жұқа қылып жайылады содансоң ауада қуратылады. Соң препаратты иммерсилы майы мен микроскопта бақыланады. Тушты дайындау әдісі: 5 мл тушты алып оны 45 мл дистилденген сумен араластырып, 30 мин автоклавда стерилизация жасалады. Сақтау мерзімі 2 апта.

Лабораториялық зерттеулер мына схема бойынша өткізілген.

1. 
   Қадағалау-дақылды мақта ұрықтарын суға жібітіп егіеді.
   
2. 
   Сынау (тәжірбе) вариантында мақта ұрығын - бактерияның культуральді сұйықтығыда 1 : 10 араласпасында жібітіліп егілді. (өсіру).
   

Зерттеу жұмыстарымыздың нәтижесінде топыраққа органикалық тыңайтқыш (көң, өсімдік қалдықтары) қолдану жолмен біз мақта резосферасынан 5 азот фиксациялаушы бактериясын бөліп алдық. Бөлініп алынған бактериялар арасынан белсенді азот фиксациялаушы қабілетіне ие бактерияларды саралау үшін біз нитрагеназалық белсенділігін анықтадық. Себебі микроорганизмдердің азотфисациялаушы қабілетінің көрсеткіші бұл нитрагеназалық белсенділік болып табылады яғни бол фермент әсері нәтижесінде ацителен С₂Н₂ этилен С₂Н₄ формаларына өтеді.

Нәтижеде бөлініп алынған бактериялар арасынан аздаған бактериялар ол қасиетке ие болғандығы анықталды. Ажыратылған бактериялар ішінен басқа дақылдармен мен салыстырғанда ең белсендісі бұл № 2 - ші дақыл болып шықты 3.1.1. – кесте

Тәжірибенің 5 – ші тәулігенде №2 – дақылымыз колониялардың айланасында қоректік ортаның қызару аймағы 22 мм құрды, ең жоғары. №4 дақылдың 9 тәулігінде қызару аймағының диаметрі 11 мм, ал бұл көрсеткіш № - 5 дақылда 8 мм болды. Ажыратылған бактериялар ішінен мүлдем нитритредуктазалық белсенділігіне ие болмаған дақылдардар –

№1 және № 3 – дақылдар болды.

Сонымен өткезілген тәжірибенің натижесіне карай тұрып біз №2 дақылды талдап алдық және кейінгі жұмыстарымызды біз № 2 - дақылмен жалғастырдық.

3.1.1. – кесте
Бөлініп алынған бактериялардың нитрагеназалық белсенділігі

Ажыратылған бактерия-лар культуралары	Тәжірибенің уақыты
	1 тәулік	2 тәулік	3 тәулік	4 тәулік	5 тәулік	6 тәулік
№ 1 дақыл	-	-	-	-	-	-
№ 2 дақыл		10	12	17,5	22	22
№ 3 дақыл	-	-	-	-	-	-
№ 4 дақыл		3	3	8	11	11,5
№ 5 дақыл				3	8	9

3.1.1. - Сурет.