Метод открытый Фехнером (1996)

1) Дизайн и последовательность праймера

Размер ПЦР-продукта BLV-env-1/BLV-env-2 составляет 598 БП. Размер ПЦР-продукта BLV-env-3/BLV-env-4 составляет 444 БП

Реакционные растворы смешивают (кроме образца ДНК) перед добавлением в отдельные реакционные трубки. Один отрицательный контроль (двойная дистилляция H2O) на пять образцов, и один положительный контроль должен быть добавлен. Общие объемы смесей рассчитываются путем умножения указанных объемов на общее количество проб, включая контрольные, плюс один.

Первая ПЦР может быть выполнена с использованием реакционного объема 50 мкл. Для одной реакции, анализ оптимизирован для 5 мкл (10×) ПЦР-буфера, 20 мкл ДНК (~1 мкг ДНК), 1.25 мкл каждого из праймеров envspecific БЛВ-env-1 и БСВ-env-2 (20 пмоль/мкл), 0.15 dNTP (каждый 25 мм), 3 мкл MgCl₂ (25 мм), 0,25 мкл Taq-полимеразы (1,25 ед) и 19,1 мкл дистиллированного H₂O.

Реакция протекает по температурному профилю: 2 минуты денатурации при 94°C; 30 циклов по 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 58°С и 60 секунд при 72°С; затем 4 минуты при 72°С.

Mix ПЦР-реагенты для первой или nested ПЦР и используйте отдельные перчатки или открывалки для каждой отдельной пробирки при добавлении образцов ДНК.  Положите образцы на лед. Нагрейте Термоблок до 94°C. Поместите образцы в Термоблок и запустите ПЦР-программы соответственно.

Загрузите примерно 10 мкл вложенных продуктов ПЦР с загрузочным буфером 20 мкл на 2% - ный агарозный гель, содержащий 0,01% этидиумбромида (или альтернативные, более безопасные пятна для визуализации продуктов ПЦР). Используя буфер 0,5 × Tris/borate/EDTA (TBE), электрофорез проводят при 90 мА в течение 2 часов. Для контроля размера продуктов амплификации рекомендуется использовать лестницу 100 bp. Анализ продуктов ПЦР проводится с помощью ультрафиолетового излучения.

- Положительные образцы должны иметь продукты ПЦР ожидаемого размера (444 bp), аналогичные положительному контролю.

- Отрицательные образцы не должны содержать продуктов ПЦР ожидаемого размера (444 bp).

- Анализ должен быть повторен, если положительный контроль остался отрицательным, или если отрицательный контроль воды является положительным.

6) Подтверждающее тестирование

Для подтверждающей идентификации продукты ПЦР могут быть секвенированы, гибридизированы с зондом или проанализированы с помощью анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) (Fechner et al., 1997).

4. 
   RT PCR
   

Было опубликовано несколько протоколов ПЦР в реальном времени для обнаружения последовательностей ПРОВИРУСОВ BLV: метод Role-Łuszczak et al. (2013) подробно описан здесь в качестве примера. Область BLV, используемая в качестве мишени, - это ген pol. Последовательность, используемая для проектирования праймеров, доступна в GenBank, регистрационный номер K02120.