7.2.2. Эксцизионная репарация
Центральное место среди систем репарации ДНК занимает система эксцизионной репарации, осуществляющая вырезание поврежденных нуклеотидов (nucleotide excision repair – NER) или азотистых оснований (base excision repair – BER). В результате сложного многостадийного процесса, в котором участвует несколько ферментов, происходит замена поврежденного участка двойной спирали ДНК на нативный. Процесс эксцизионной репарации условно можно разделить на следующие этапы: а) распознавание поврежденного участка ДНК; б) надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка; в) его удаление (эксцизия); г) заполнение бреши в процессе репаративного синтеза; д) лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК.
В зависимости от длины вырезаемого участка ДНК, содержащего повреждения, и образующейся бреши, заполняемой затем ДНК-полимеразами, различают short patch repair pathway и long patch repair pathway (репарация коротких и длинных ресинтезируемых трактов, соответственно).
Репарация путем удаления поврежденных азотистых оснований (BER)
Система BER отвечает за защиту геномной ДНК от повреждений, вызываемых главным образом алкилирующими агентами, а также эндогенными генотоксическими соединениями, включая внутриклеточные радикалы кислорода и другие реакционноспособные метаболиты.
BER начинает функционировать с отщепления поврежденного пуринового или пиримидинового основания от дезоксирибозы. Процесс происходит под действием ключевого фермента – ДНК-гликозилазы, обладающего способностью отщеплять большое число модифицированных оснований ДНК и их производных, образующихся под действием химических мутагенов. Удаление конкретных модифицированных оснований осуществляют разные ДНК-гликозилазы, обладающие различной специфичностью. ДНК-гликозилазы гидролизуют N-гликозидные связи между поврежденными или модифицированными азотистыми основаниями и остатками дезоксирибозы. Происходит удаление соответствующих азотистых оснований, в результате чего образуется АР-дезоксирибоза (apurinic/apyrimidinic deoxyribose) (рис. 7.4). Повреждения ДНК, связанные с появлением некодирующего апуринового/апиримидинового (AP) участка, менее опасны для клеток по сравнению с ошибочно кодирующими основаниями, приводящими к мутациям, поскольку AP-участки допускают осуществление пострепликативной репарации повреждений.
АР-дезоксирибоза далее вырезается с помощью двух ферментов. АР-лиаза освобождает ее 3'-конец, а АР-эндонуклеаза гидролизует ее 5'-концевую фосфодиэфирную связь в АР-сайте (рис. 7.4). Образовавшаяся после удаления АР-участка однонуклеотидная брешь затем заполняется с помощью ДНК-полимераз. У E. coli репаративный синтез ДНК выполняет ДНК-полимераза I, у эукариот – низкопроцессивная ДНК-полимераза β. Последний этап эксцизионной репарации, восстанавливающий целостность цепочки ДНК, осуществляется с помощью ДНК-лигазы, катализирующей "сшивание" однонитевого разрыва. Из трех ДНК-лигаз, которыми обладают клетки животных, в BER, по-видимому, участвует ДНК-лигаза III.
Рис.7.4. Основные пути и этапы эксцизионной репарации у животных.
Репарация путем удаления нуклеотидов (NER)
В системе NER поврежденные азотистые основания вырезаются в составе олигонуклеотидов. NER может осуществляться двумя путями. В первом случае происходит гидролиз фосфодиэфирной связи по 3'- или 5'-концу на некотором расстоянии от ошибочно спаренного (поврежденного) нуклеотида. Далее под действием 5'3'- (или 3'5'-)экзонуклеазы, гидролизующей цепь ДНК нуклеотид за нуклеотидом в соответствующем направлении от первоначального одноцепочечного разрыва в репарируемой ДНК, этот "неправильный" нуклеотид целиком удаляется. Образующаяся брешь далее заполняется ДНК-полимеразой (рис. 7.4). Такой механизм репарации реализуется в клетках E. coli и человека для вырезания неповрежденных (немодифицированных) ошибочно спаренных нуклеотидов. Механизм последовательного эндо- и экзонуклеазного расщепления ДНК не используется для удаления поврежденных (измененных) нуклеотидов. Это связано, по-видимому, с тем, что такие нуклеотиды (например, возникшие в результате образования аддуктов с мутагенами) часто являются ингибиторами экзонуклеаз.
Второй механизм эксцизионной репарации функционирует благодаря использованию ферментной системы, которая вносит одноцепочечные разрывы по обе стороны от поврежденного нуклеотида на некотором расстоянии от него и затем удаляет одноцепочечный фрагмент ДНК, содержащий измененный нуклеотид. Такой механизм репарации обнаружен у всех исследованных видов животных. После распознавания поврежденного участка ДНК происходит двойное надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка и его удаление (эксцизия). В универсальном механизме эксцизионной репарации как прокариоты, так и эукариоты гидролизуют 3 – 5-ю фосфодиэфирную связь с 3'-конца от повреждения (см. рис. 7.4). При этом прокариоты гидролизуют также 8-ю связь от 5'-конца измененного нуклеотида, тогда как у эукариотических организмов происходит одноцепочечный разрыв на расстоянии 21–25 нуклеотидов от повреждения со стороны его 5'-конца. Таким образом, прокариоты удаляют измененный нуклеотид в составе 12–13-членных олигомеров, тогда как эукариоты – в составе одноцепочечных фрагментов ДНК длиной в 27–29 нуклеотидов. Ферментная система, вносящая такие двойные одноцепочечные разрывы, получила название эксцизионной нуклеазы (эксцинуклеазы).
Образующаяся в молекуле репарируемой ДНК одноцепочечная брешь далее застраивается с помощью ДНК-полимеразы. Репаративный синтез ДНК у человека может осуществляться с участием ДНК-полимераз δ и ε и является PCNA-зависимым. PCNA связывается с системой праймер–матрица под действием фактора репликации RFC, откуда следует, что последний также участвует в репаративном синтезе ДНК. Лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК осуществляется ДНК-лигазой, которая восстанавливает фосфодиэфирную связь.
Помимо поврежденных (модифицированных) оснований ферментная система NER человека распознает и удаляет одиночные ошибочно спаренные нуклеотиды, а также петли длиной в 1–3 нуклеотида. Однако NER не может распознать, нуклеотид какой цепи ДНК оказывается правильным. В результате происходит вырезание неповрежденных неспаренных нуклеотидов из любой цепи случайным образом. Но при распознавании поврежденных нуклеотидов NER человека способна различать цепи ДНК. В частности, при наличии в ДНК димеров тимина циклобутанового типа вырезание нуклеотидов происходит исключительно из поврежденной цепи. Механизм такого распознавания поврежденных участков ДНК и самих поврежденных оснований в настоящее время неизвестен. Следует заметить, что система NER способна распознавать повреждения, как сильно, так и слабо деформирующие вторичную структуру ДНК.
Достарыңызбен бөлісу: |
