59
сонымен қатар денсаулық сақтау саласында
зертханалық диагности-
ка жүргізуде, санитарлық-эпидемиологиялық жəне ветеринарлық
қадағалау жүйесінде (генотиптеу, жұқпалы аурулардың диагности-
касы, генетикалық модификациялық ағзаларды анықтау, ет түрлерін
жəне ет өнімдерінің ингредиенттерін жəне басқаларды идентифика-
циялау) кеңінен қолданылады.
Зертханалық диагностика құралы ретінде ПТР əдісінің негізінде
ізделіп отырған фрагменттің жинақталуына арналған полимеразды
тізбекті реакцияны қолдана отырып, анықталатын ағзаға тəн ДНҚ-
ның кішкентай фрагментін анықтауда жатыр.
ПТР əдісін қолдану арқылы анализді жүргізу əдістемесі:
1) сынама
материалынан ДНҚ- ын бөліп алу;
2) ДНҚ-ның спецификалық фрагменттерін амплификациялау;
3) амплификация өнімдерін детектирлеу сияқты үш кезеңнен
тұрады.
ДНҚ-ын бөліп алу. Талдау жүргізудің бұл кезеңінде зерттелетін
үлгі арнайы өңдеуге ұшырайды, нəтижесінде:
– жасушалы материалдың лизисі;
– полимеразды тізбекті реакцияны тежейтін заттардан тазарту
(полисахаридтер, липидтер,
май қышқылдары, белоктар жəне т.б.);
– ПТР ингибиторларынан босаған, кейінгі амплификацияға дайын
ДНҚ-ның таза препаратын бөліп алу сияқты жұмыстар жүргізіледі.
ДНҚ-ның спецификалық фрагменттерін амплификациялау.
Бұл кезеңде кейінгі анықталуына қажетті мөлшерде ДНҚ-ның қысқа
спецификалық фрагменттерінің жинақталуы жүреді.
Амплификация негізінде ДНҚ-ның ферменті полимеразаның
көмегімен катализделетін, ДНҚ-ның спецификалық бөлімдерінің
көшірме сандарын бірнеше рет ұлғайтудың табиғи процесі жатыр.
ДНҚ матрицасының комплементарлы құрылысын бітіру процесі, со-
нымен қатар ДНҚ репликациясы деп аталады.
ДНҚ амплификациясы:
– ДНҚ денатурациясы (қос спиральды тарқату,
ДНҚ жіптерінің
айырылысы);
– ДНҚ-ның қысқа екітізбекті бөлімдерінің түзілуі (ДНҚ синтезін
инициациялауға қажетті «күйдіргіш»);
– ДНҚ жаңа тізбегінің синтезі (екі жіптің комплементарлы
құрылысын бітіру) сияқты бірнеше кезеңнен тұрады.
Бұл процесті нақты ағзаларға тəн, ДНҚ-ның қысқа бөлімдерінің
көшірмесін алуға қолдануға болады.
60
Термотұрақты ДНҚ-полимеразаның (Taq-полимеразалар)
ашылуы ДНҚ-ның репликация процесін циклді етіп, оны in vitro
жұмысына қолдануға мүмкіндік берді. Синтез циклдері бірнеше рет
қайталанғанда ДНҚ-ның спецификалық фрагменті көшірмесінің
сандары экспоненциалды түрде ұлғаяды,
бұл анықталатын
ағзалардың жеке жасушаларынан тұруы мүмкін талданатын
материалдың азғантай мөлшерінен, əртүрлі əдістермен (электрофо-
рез, иммуноферменттік анализ (ИФА) жəне т.б.) идентификациялау
үшін ДНҚ-көшірмелерінің жеткілікті мөлшерін алуға мүмкіндік
береді.
Тізбектің комплементарлы құрылысын бітіру ДНҚ кезектілігінің
кез келген нүктесінде басталмайды, тек белгілі бастапқы блоктар-
да – қысқа екі жіпті бөлімдерде басталады. Осындай блоктарды
ДНҚ-ның спецификалық бөлімдеріне
біріктіргенде жаңа тізбектің
синтез процесін ДНҚ- тізбегінің барлық ұзындығына емес, тек осы
бөліміне бағыттауға болады.
ДНҚ-ның берілген бөлімдерінде бастапқы блоктарды құру
үшін праймерлер деп аталатын екі олигонуклеотидті «күйдіргіш
(шүрпілерді)» қолданады, олар спецификалық фрагмент шекарасын-
да ДНҚ кезектілігіне комплементарлы болып келеді жəне ДНҚ-ның
жаңа тізбектерінің құрылысын тек праймерлер арасында аяқтауға
бағытталған.
3-сурет. Полимеразды
тізбекті реакцияның
бастапқы компоненттері (ПТР)
Осылайша, амплификацияны жүргізу үшін келесі негізгі компо-
ненттер қажет (
3-сурет):
- ДНК-матрица – ізделіп отырған спецификалық фрагменті бар
ДНҚ немесе оның бөлігі;
61
– праймерлер – матрицалық ДНҚ бөлімдеріне комплементар-
лы синтетикалық олигонуклеотидтер (16-30 нуклеотидті жұптар),
олардың арасында жүйелі – нысана бар (ДНҚ-ның спецификалық
фрагменті);
– ДНҚ-ның спецификалық фрагменті жəне праймерлер, ампли-
фикация жүргізу барысында оларды таңдау өте маңызды, жəне
анализді жүргізу сапасына əсер етеді;
– дезоксинуклеотидтрифосфаттар (дНТФ)
қоспасы-төрт дНТФ
қоспасы, ол жаңа комплементарлы ДНҚ тізбектерін синтездеуге
арналған материал болып табылады;
– Таq-полимераза ферменті – термотұрақты ДНҚ-полимераза,
ол ДНҚ синтездейтін, өсіп келе жатқан тізбекке нуклеотидті негізді
біртіндеп қосу арқылы праймерлер тізбегін ұзартуды жеделдетеді
(катализдейді);
– ПТР-ның оптималды жағдайын рН-тың тұрақты мəнін
қамтамасыз ететін, катиондар жəне аниондар концентрациясы бола-
тын буфер-ерітінді.
Амплификацияның əрбір циклі əртүрлі
температуралық режимде
жүретін үш кезеңнен тұрады (
4-сурет):
1-кезең.
ДНК денатурациясы 93-95°С температурада 20-40 се-
кунд аралығында жүреді (қос спиральды тарқату).
2-кезең. Праймерлерді біріктіру (күйдіру). Кезектілікпен
спецификалық бөлімнің шекарасында ДНҚ-ның қарама-қарсы
тізбегінде жүреді. Праймерлердің əрбір жұбының жеке күйдіру тем-
пературасы болады, оның мəні 50-65°С аралығында болады. Күйдіру
уақыты-20-60 с құрайды.
3-кезең.
ДНҚ тізбектерінің құрылысын бітіру. ДНҚ тізбектерінің
комплементарлы құрылысын бітіру, праймерлердің бірігу
бөлімдерінен бастап, қарама – қарсы бағытта тізбектің 5’-соңынан
3’-соңына қарай жүреді.
ДНҚ-ның жаңа тізбектерін синтездеуге арналған матери-
ал ретінде ерітіндіге қосылатын дезоксинуклеотидтрифосфаттар
(дНТФ) қолданылады. Синтез процесі
термотұрақты ДНҚ полиме-
раза (Taq-полимеразалар) ферментімен қатализденеді жəне 70-72°С
температурада жүреді (
4-суретті қараңыз). Синтездің жүру уақыты
– 20-40 с құрайды.
