d(pN)m + n dNTP ↔ d(pN)m(pN)n + n РРi ,
где d(pN)m – олигонуклеотидный праймер,
РРi – неорганический пирофосфат.
В этом случае нуклеотидный состав синтезированной цепи ДНК и ее структура зависят от состава смеси предшественников. При равном их соотношении включение dNTP носит случайный характер.
Благодаря своим свойствам TDT используется для введения радиоактивной метки в составе меченых нуклеотидов в 3'-концы ДНК, а также для присоединения к 3'-концам фрагментов ДНК (особенно кДНК) протяженных гомополимерных последовательностей нуклеотидов (коннекторов) для последующего их клонирования.
6.1.1. Характеристики ДНК-полимераз
ДНК-полимеразы осуществляют последовательное присоединение остатков dNTP к 3'-концу растущей цепи ДНК в соответствии со структурой матрицы. Фермент связывается с участком ДНК, в котором одна из цепей непрерывна (матрица), а другая заканчивается 3'-концом и содержит 3'-гидроксил, необходимый для продолжения цепи (праймер). Комплекс связывает нуклеотид, соответствующий звену матрицы, присоединяет его к цепи и перемещается на один шаг.
К общим свойствам ДНК-полимераз относятся:
полимеризация различных по структуре dNTP в цепи ДНК,
необходимость матрицы (за исключением ТДТ),
необходимость затравки с 3'-ОН группой,
общее направление роста цепи 5'→3',
высокая точность биосинтеза ДНК.
В зависимости от природы матрицы ДНК-полимеразы делятся на ДНК-зависимые ферменты (катализирующие репликацию и репарацию) и РНК-зависимые (обратные транскриптазы).
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют элонгацию затравок по схеме:
(PdN)n + dNTP ↔ (PdN)n+1 + PPi
Матрицей для синтеза является ДНК, а в качестве затравки может использоваться фрагмент ДНК или РНК. Помимо нуклеотидилтрансферазного каталитического центра, осуществляющего полимеризацию в направлении от 5' к 3', в ДНК-полимеразах может присутствовать экзонуклеазный центр, способный удалять ошибочно включенные нуклеотидные остатки в направлении от 3' к 5' и выполняющий корректорскую функцию при синтезе ДНК.
ДНК-полимераза III E. coli и эукариотические ДНК-полимеразы , , , относятся к высокомолекулярным ферментам. Они состоят из нескольких субъединиц и выполняют в основном репликативные функции, синтезируя длинные цепи ДНК. ДНК-полимераза I E. coli и ДНК-полимераза эукариот состоят из одной полипептидной цепи с небольшой молекулярной массой и застраивают короткие пробелы или бреши.
Важной характеристикой ДНК-полимераз является их процессивность. Кинетический механизм матричного синтеза предполагает два предельных случая – при дистрибутивном синтезе после присоединения очередного нуклеотида к растущей цепи ДНК фермент диссоциирует из комплекса с ДНК, а затем ассоциирует с новым участком матрицы-затравки. Другой предельный случай – полностью процессивный процесс. Он включает транслокацию фермента вдоль матрицы и большое количество циклов реакции присоединения нуклеотидных остатков. В зависимости от количества нуклеотидных остатков, включенных за цикл связывания ДНК-полимеразы с матрицей-затравкой, процесс полимеризации может быть умеренно процессивным или полностью процессивным, если это число соответствует длине матрицы.
Холофермент ДНК-полимеразы III E. coli синтезирует ведущую цепь ДНК длиной 50 000 нуклеотидов, ни разу не диссоциируя от ДНК-матрицы. Для ДНК-полимеразы эукариот значение процессивности не превышает 10–15 нуклеотидных остатков. ДНК-полимераза является дистрибутивным ферментом и встраивает за цикл полимеризации по одному нуклеотидному остатку. Процессивность ДНК-полимераз зависит от матрицы, повышается при переходе от кор- к холоферментам, при взаимодействии с другими белковыми субъединицами.
Особое биологическое значение имеет точность матричного синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами. Любое ошибочное включение природного нуклеотидного остатка, если оно не будет исправлено при дальнейшем репликационном контроле, на уровне вновь образованного дуплекса, как правило, приводит к мутации при последующих раундах репликации. В обычных условиях биосинтеза ДНК в клетках мутации происходят с частотой 10-10 –10-11. Такая точность не имеет аналогов среди других ферментативных процессов и определяется существованием нескольких этапов, обеспечивающих точность копирования матрицы при биосинтезе ДНК и коррекции уже возникших ошибок:
1. Первичный отбор комплементарного матрице dNTP.
2. Редактирование (коррекция) возникших ошибочных включений.
3. Репарация ошибочно включенных нуклеотидных остатков в составе дуплекса ДНК.
1. Первичный отбор начинается с образования канонических уотсон-криковских пар. Энергетически это более выгодно, и, кроме того, правильно образованный комплекс вызывает конформационное изменение молекулы ДНК-полимеразы, что ускоряет реакцию элонгации и последующую транслокацию фермента. Тем не менее ошибочные включения возникают в среднем с частотой 10-6 для ДНК-зависимых ДНК-полимераз и 10-4 для обратных транскриптаз.
2. Большинство фаговых и бактериальных ДНК-полимераз, а также многие ДНК-полимеразы δ, ε, γ эукариот имеют дополнительный активный центр, катализирующий 3'-5'-экзонуклеазный гидролиз. При включении некомплементарного 3'-нуклеотидного остатка и возникновении ошибочной пары ДНК-полимеразы выщепляют ошибочно включенный 3'-концевой нуклеотидный остаток благодаря 3'-5'-экзонуклеазной активности. Эукариотические ДНК-полимеразы α и β, а также обратные транскриптазы ретровирусов не имеют такой активности. Тем не менее эти ферменты катализируют включение с достаточно высокой точностью (за исключением вирусных обратных транскриптаз, число ошибок для которых примерно 10-4). Механизмы коррекции в этих случаях строго не выяснены и, по-видимому, разнообразны.
3. Репарация ДНК как результат специфического контроля структуры дуплекса синтезированной ДНК осуществляется комплексом ферментов (см. раздел 7). Репаративную функцию у эукариот выполняют ДНК-полимераза β (дистрибутивный фермент), а также, вероятно, недавно открытые полимеразы ζ и η. В заполнении длинных брешей участвуют ДНК-полимеразы δ и ε и, возможно, α. У E. coli к репаративным ферментам относятся ДНК-полимеразы I, II и IV.
ДНК-полимеразы играют ключевую роль в процессах репродукции генома и сохранения его интактной структуры, осуществляя синтез дочерних нитей ДНК при репликации и участвуя в репарации поврежденных участков ДНК.
Достарыңызбен бөлісу: |
