Резюме описание и значение заболевания


Метод открытый Фехнером (1996)



жүктеу 51,05 Kb.
бет9/20
Дата16.01.2022
өлшемі51,05 Kb.
#32589
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   20
2.04.10 МЭБ лейкоз на рус.яз

1.2.4.1 Метод открытый Фехнером (1996)

1) Дизайн и последовательность праймера




Oligo

Env-Sequence (5’–3’)

Position

BLV-env-1

TCT-GTG-CCA-AGT-CTC-CCA-GAT-A

5032–5053

BLV-env-2

AAC-AAC-AAC-CTC-TGG-GAA-GGG

5629–5608

BLV-env-3

CCC-ACA-AGG-GCG-GCG-CCG-GTT-T

5099–5121

BLV-env-4

GCG-AGG-CCG-GGT-CCA-GAG-CTG-G

5542–5521

Размер ПЦР-продукта BLV-env-1/BLV-env-2 составляет 598 БП. Размер ПЦР-продукта BLV-env-3/BLV-env-4 составляет 444 БП


2) Реакционная смесь

Реакционные растворы смешивают (кроме образца ДНК) перед добавлением в отдельные реакционные трубки. Один отрицательный контроль (двойная дистилляция H2O) на пять образцов, и один положительный контроль должен быть добавлен. Общие объемы смесей рассчитываются путем умножения указанных объемов на общее количество проб, включая контрольные, плюс один.

Первая ПЦР может быть выполнена с использованием реакционного объема 50 мкл. Для одной реакции, анализ оптимизирован для 5 мкл (10×) ПЦР-буфера, 20 мкл ДНК (~1 мкг ДНК), 1.25 мкл каждого из праймеров envspecific БЛВ-env-1 и БСВ-env-2 (20 пмоль/мкл), 0.15 dNTP (каждый 25 мм), 3 мкл MgCl2 (25 мм), 0,25 мкл Taq-полимеразы (1,25 ед) и 19,1 мкл дистиллированного H2O.

Реакция протекает по температурному профилю: 2 минуты денатурации при 94°C; 30 циклов по 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 58°С и 60 секунд при 72°С; затем 4 минуты при 72°С.


3) Лабораторная процедура

Mix ПЦР-реагенты для первой или nested ПЦР и используйте отдельные перчатки или открывалки для каждой отдельной пробирки при добавлении образцов ДНК.  Положите образцы на лед. Нагрейте Термоблок до 94°C. Поместите образцы в Термоблок и запустите ПЦР-программы соответственно.


4) Электрофорез агарозного геля

Загрузите примерно 10 мкл вложенных продуктов ПЦР с загрузочным буфером 20 мкл на 2% - ный агарозный гель, содержащий 0,01% этидиумбромида (или альтернативные, более безопасные пятна для визуализации продуктов ПЦР). Используя буфер 0,5 × Tris/borate/EDTA (TBE), электрофорез проводят при 90 мА в течение 2 часов. Для контроля размера продуктов амплификации рекомендуется использовать лестницу 100 bp. Анализ продуктов ПЦР проводится с помощью ультрафиолетового излучения.


5) Интерпретация полученных результатов

- Положительные образцы должны иметь продукты ПЦР ожидаемого размера (444 bp), аналогичные положительному контролю.

- Отрицательные образцы не должны содержать продуктов ПЦР ожидаемого размера (444 bp).

- Анализ должен быть повторен, если положительный контроль остался отрицательным, или если отрицательный контроль воды является положительным.


6) Подтверждающее тестирование

Для подтверждающей идентификации продукты ПЦР могут быть секвенированы, гибридизированы с зондом или проанализированы с помощью анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) (Fechner et al., 1997).


      1. RT PCR

Было опубликовано несколько протоколов ПЦР в реальном времени для обнаружения последовательностей ПРОВИРУСОВ BLV: метод Role-Łuszczak et al. (2013) подробно описан здесь в качестве примера. Область BLV, используемая в качестве мишени, - это ген pol. Последовательность, используемая для проектирования праймеров, доступна в GenBank, регистрационный номер K02120.



жүктеу 51,05 Kb.

Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   20




©g.engime.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет
рсетілетін қызмет
халықаралық қаржы
Астана халықаралық
қызмет регламенті
бекіту туралы
туралы ережені
орталығы туралы
субсидиялау мемлекеттік
кеңес туралы
ніндегі кеңес
орталығын басқару
қаржы орталығын
қаржы орталығы
құрамын бекіту
неркәсіптік кешен
міндетті құпия
болуына ерікті
тексерілу мемлекеттік
медициналық тексерілу
құпия медициналық
ерікті анонимді
Бастауыш тәлім
қатысуға жолдамалар
қызметшілері арасындағы
академиялық демалыс
алушыларға академиялық
білім алушыларға
ұйымдарында білім
туралы хабарландыру
конкурс туралы
мемлекеттік қызметшілері
мемлекеттік әкімшілік
органдардың мемлекеттік
мемлекеттік органдардың
барлық мемлекеттік
арналған барлық
орналасуға арналған
лауазымына орналасуға
әкімшілік лауазымына
инфекцияның болуына
жәрдемдесудің белсенді
шараларына қатысуға
саласындағы дайындаушы
ленген қосылған
шегінде бюджетке
салығы шегінде
есептелген қосылған
ұйымдарға есептелген
дайындаушы ұйымдарға
кешен саласындағы
сомасын субсидиялау