Иммунодиффузия агаровым гелем

Тест AGID-это специфический, но не очень чувствительный тест для обнаружения антител в образцах сыворотки крови отдельных животных. Однако он непригоден для образцов молока (за исключением первых молозивных) из-за отсутствия специфичности и чувствительности. АГИД прост и удобен в применении и доказал свою высокую полезность и эффективность в качестве основы для схем эрадикации. Эталонные сыворотки входят в состав коммерческих тест-наборов AGID.

А 0,8-1,2% раствор агара или агарозы готовят в 0,2 М Трис-буфере, рН 7,2, с 8,5% NaCl. Один из способов приготовления агара заключается в растворении 24,23 г Трис-метиламина в 1 л дистиллированной воды и доводке до рН 7,2 с 2,5 м HCl. Хлорид натрия (85 г) растворяют в 250 мл Трис/HCl и доводят до 1 литра. Добавляют агарозу (8 г) и нагревают смесь в скороварке или автоклаве со скоростью 4,55 кг/кв. м. см в течение 10 минут. Смесь разливают в 15 мл аликвоты, которые можно хранить при 4°С в течение примерно 6 недель.

Антиген должен содержать специфический гликопротеин gp51 BLV. Антиген получают в подходящей системе культивирования клеток, такой как постоянно инфицированные монослои клеток FLK. Клетки, используемые для производства антигена BLV, должны быть свободны от некитопатического вируса бычьей вирусной диареи, а также от бычьих ретровирусов, бычьего вируса иммунодефицита (лентивируса) и бычьего синцитиального вируса (спумавируса). После 3-х лет -4-дневная культура при 37°С, питательная среда заменяется питательной средой. Клетки собирают через 7 дней с использованием стандартного раствора трипсина / версена. Суспензию клеток центрифугируют при 500 г в течение 10 минут. Клетки ресуспендируют в питательной среде; 30% клеток возвращают в культуральный сосуд, а остальное выбрасывают. Все супернатанты культуры собираются. Супернатанты концентрируются 50- В 100 раз по доступным методикам. Это может быть сделано путем концентрирования в Вискинг трубе, погруженной в полиэтиленгликоль, или путем осаждения сульфатом аммония с последующей ультрафильтрацией, или путем осаждения в полиэтиленгликоле с последующим обессоливанием и разделением по размерам на колонне из полиакриламидных шариков. Антиген содержит преимущественно gp51, но может также содержать p24.

Антиген может быть стандартизирован для гликопротеина gp51 титрованием против эталонной сыворотки МЭБ E05 следующим образом: производится двукратное разведение антигенного препарата. Самое высокое разбавление которое, испытыванный против неразбавленной сыворотки справки E05 OIE, дает линию преципитации equidistant между антигеном и сывороткой будет содержать один блок. В тесте используются две единицы антигена.