59
сонымен қатар денсаулық сақтау саласында зертханалық диагности-
ка жүргізуде, санитарлық-эпидемиологиялық жəне ветеринарлық
қадағалау жүйесінде (генотиптеу, жұқпалы аурулардың диагности-
касы, генетикалық модификациялық ағзаларды анықтау, ет түрлерін
жəне ет өнімдерінің ингредиенттерін жəне
басқаларды идентифика-
циялау) кеңінен қолданылады.
Зертханалық диагностика құралы ретінде ПТР əдісінің негізінде
ізделіп отырған фрагменттің жинақталуына арналған полимеразды
тізбекті реакцияны қолдана отырып, анықталатын ағзаға тəн ДНҚ-
ның кішкентай фрагментін анықтауда жатыр.
ПТР əдісін қолдану арқылы анализді жүргізу əдістемесі:
1) сынама материалынан ДНҚ- ын бөліп алу;
2) ДНҚ-ның спецификалық фрагменттерін амплификациялау;
3) амплификация өнімдерін детектирлеу сияқты үш
кезеңнен
тұрады.
ДНҚ-ын бөліп алу.
Талдау жүргізудің бұл кезеңінде зерттелетін
үлгі арнайы өңдеуге ұшырайды, нəтижесінде:
– жасушалы материалдың лизисі;
– полимеразды тізбекті реакцияны тежейтін заттардан тазарту
(полисахаридтер, липидтер,
май қышқылдары, белоктар жəне т.б.);
– ПТР ингибиторларынан босаған, кейінгі амплификацияға дайын
ДНҚ-ның таза препаратын бөліп алу сияқты жұмыстар жүргізіледі.
ДНҚ-ның спецификалық фрагменттерін амплификациялау.
Бұл кезеңде кейінгі анықталуына қажетті мөлшерде ДНҚ-ның қысқа
спецификалық фрагменттерінің жинақталуы жүреді.
Амплификация негізінде ДНҚ-ның ферменті полимеразаның
көмегімен катализделетін, ДНҚ-ның
спецификалық бөлімдерінің
көшірме сандарын бірнеше рет ұлғайтудың табиғи процесі жатыр.
ДНҚ матрицасының комплементарлы құрылысын бітіру процесі, со-
нымен қатар ДНҚ репликациясы деп аталады.
ДНҚ амплификациясы:
– ДНҚ денатурациясы (қос спиральды тарқату, ДНҚ жіптерінің
айырылысы);
– ДНҚ-ның қысқа екітізбекті бөлімдерінің түзілуі (ДНҚ синтезін
инициациялауға қажетті «күйдіргіш»);
– ДНҚ жаңа тізбегінің синтезі (екі жіптің комплементарлы
құрылысын бітіру) сияқты бірнеше кезеңнен тұрады.
Бұл процесті нақты ағзаларға тəн,
ДНҚ-ның қысқа бөлімдерінің
көшірмесін алуға қолдануға болады.
60
Термотұрақты ДНҚ-полимеразаның (Taq-полимеразалар)
ашылуы ДНҚ-ның репликация процесін циклді етіп, оны in vitro
жұмысына қолдануға мүмкіндік берді. Синтез циклдері бірнеше рет
қайталанғанда ДНҚ-ның спецификалық фрагменті көшірмесінің
сандары экспоненциалды түрде ұлғаяды, бұл анықталатын
ағзалардың жеке жасушаларынан тұруы мүмкін талданатын
материалдың азғантай мөлшерінен, əртүрлі əдістермен (электрофо-
рез, иммуноферменттік анализ (ИФА) жəне т.б.)
идентификациялау
үшін ДНҚ-көшірмелерінің жеткілікті мөлшерін алуға мүмкіндік
береді.
Тізбектің комплементарлы құрылысын бітіру ДНҚ кезектілігінің
кез келген нүктесінде басталмайды, тек белгілі бастапқы блоктар-
да – қысқа екі жіпті бөлімдерде басталады. Осындай блоктарды
ДНҚ-ның спецификалық бөлімдеріне біріктіргенде жаңа тізбектің
синтез процесін ДНҚ- тізбегінің
барлық ұзындығына емес, тек осы
бөліміне бағыттауға болады.
ДНҚ-ның берілген бөлімдерінде бастапқы блоктарды құру
үшін праймерлер деп аталатын екі олигонуклеотидті «күйдіргіш
(шүрпілерді)» қолданады, олар спецификалық фрагмент шекарасын-
да ДНҚ кезектілігіне комплементарлы болып келеді жəне ДНҚ-ның
жаңа тізбектерінің құрылысын тек праймерлер
арасында аяқтауға
бағытталған.
Достарыңызбен бөлісу: