Қазақстан республикасы білім жəне ғылым министрлігі м. Ж. Еркебаев, Қ. С. Құлажанов, Д. Б. Тəттібаева, А. Ы. Мəуленов

66
ДНҚ мөлшері
(10
-15
мольдер)
Электрофорез
Иммуноферменттік детекциясы бар
гидризациялы зондтар əдісі 
7-сурет. 
Детекция əдісінің салыстырмалы сезімталдығы
Гибридизациялы зондтар əдісі
. Детектрлеудің электрофорети-
калық əдісінің бірқатар кемшіліктері бар, жекелеп айтқанда 
сезімталдығы төмен, нəтижелерді есептеуде субьективті, бір 
ампликондағы əртүрлі ДНҚ-дарды анықтауы шектелген. Бала-
ма ретінде детекцияның гибридизациялы сызбалары ұсынылған. 
Бұл сызбаларда амплификация нəтижесінде пайда болған ДНҚ 
фрагменттері спецификалық олигонуклеотидті зондтармен 
гибридтеледі (екітізбекті кешендер – «гибридтерді» түзеді). Мұндай 
кешендерді тіркеу колориметриялық немесе флуориметриялық 
əдіспен жүргізілген. Тəжірибеде жиірек иммуноферменттік анализ-
де қолданылатын түріне ұқсас микропланшеттік формат жəне детек-
ция жүйесін қолданады. Детекцияның иммуноферменттік жүйесі 
бар гибридизациялы зондтар əдісінің сезімталдығы горизонтальды 
электрофорез əдісінің сезімталдығынан шамамен алғанда, 100 есе 
асып түседі (
7-сурет
).
Массалық скрининг тұрғысынан алғанда гибридизациялық 
əдістер үлкен қызығушылық тудырады, себебі қажетті жабдықтар 
болған жағдайда оңай автоматтандырылуы мүмкін.
«
Шынайы уақыттағы» ПТР.
Соңғы уақытта амплификация 

67
өнімдеріндегі детектрленетін ДНҚ мөлшерін бағалау үшін «шынайы 
уақыттағы» ПТР деп аталатын əдіс қолданылады. Бұл детекция 
əдісі бойынша амплификация өнімдерінің жинақталу кинетикасын 
бақылауға мүмкіндік беретін арнайы реагенттер қолданылады жəне 
аспаптармен қамтамасыз етіледі.
«Шынайы» уақыттағы ПТР-ды іске асырудың бірнеше 
нұсқаулары бар, олардың біреуі келесідей жүргізіледі. Реакциялық 
қоспаға өз құрамында ерекше нуклеотидтер реактивтерімен 
таңбаланған, тек бос күйінде сəулелеуге қабілетті гибридиза-
циялы зондтар енгізеді. Күйдіру кезеңінде ампликондардың 
ішкі бөліктерімен зондтар гибридизацияланады. ДНҚ синтез-
деу процесінде Taq-полимераза зондтарды өзінің экзонуклеазды 
белсенділігімен (активтілік) бұзады, нəтижесінде таңбаланған ну-
клеотидтер ерітіндіге түседі жəне ол жерде олар сəуле шаша (флу-
оресцирлей) бастайды. On-line режимінде арнайы детектормен 
тіркелетін флуорисценция қарқыны амплификация өнімдерінің 
санына сəйкес келеді. Керісінше, егер гибридтеу жүрмесе, зонд 
бүтін болып қалады жəне оның құрамына кіретін нуклеотидтер 
сəуле шашпайды (флуоресцирлемейді).
Үлгілерді зерттеу барысында тəжірибенің əрбір сериясында ампли-
фикацияны бақылайды (бірнеше 10-рет ДНҚ-ны қозғайды). Зерттел-
ген үлгі жəне бақылау пробиркаларының реакциялық қоспаларында 
бос нуклеотидтердің түзілу кинетикасын салыстыру арқылы ДНҚ-ның 
бақылау препараттарын зерттеу үлгісінде жəне диапозонында ДНҚ 
концентрациясының жартылай санын бағалауға мүмкіндік туады.
2.3.3. ПТР-зертханаларын ұйымдастыру
ПТР-технологиясы диагностикасының сезімталдығы өте 
жоғары болғандықтан, ПТР-зертханаларын ерекше жетік 
құрылғыларымен қамтамасыз ету қажет. Бұл əдістің күрделі про-
блемасы, реакция қоспасы сыртқы ортаның спецификалық ДНҚ-
мен контаминациялануы мүмкін, нəтижесінде дұрыстығы жалған 
нəтижелер пайда болады.
ДНҚ-ның спецификалық молекулалары амплификация реак-
циясының нысанасы қызметін атқаруы мүмкін, сыртқы ортаға сы-
нама дайындалатын үлгіден немесе амплификация аяқталған про-
биркадан түсуі мүмкін. ПТР-зертханаларын жеткілікті деңгейде 
ойластырмаған жағдайда, сыртқы ортаның ДНҚ-нысаналармен кон-

68
таминациялану ықтималдығы жəне реакция қоспасының тұрақты 
түрде ластану ықтималдығы өте жоғары.
Контаминациямен күресудің бірнеше əдістері бар, олардың 
ішіндегі ең жақсысы – ПТР-зертханаларын дұрыс ұйымдастыру 
жəне оның жұмыс істеу режимі.
Технологиялық операциялар саны бойынша ПТР-зертханалар 
үш зонаға бөлінуі тиіс (
8-сурет
). Барлық үш зона оқшауланған 
бөлме түрінде, предбоксниктермен жабдықталуы тиіс. Ауаны 
сүзу құрылғысының болғаны тиіс. Егер бірінші жəне екінші зо-
наны қосуға рұқсат етілсе (арнайы бокстар болған жағдайда), 
детекцияға арналған бөлме басқа екі зонадан қашық орналасуы 
тиіс (басқа қабат, басқа ғимарат) жəне олармен байланысқан жел-
дету жүйесі болмауы тиіс. Бұл ПТР-ды ұйымдастыру барысындағы 
қатаң талаптардың бірі.

жүктеу 1,24 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: