Протопластардан регенерант өсімдіктер шығару

Ен бірінші болып 1971 жылы Такебе протопластарды нәтижелі өсіріп, олардан осімдіктерді шығаруға болатындығын дәлелдеді. Лайыкты жағдайда протопластар клетка кабығын кайта түзіп, кәдімгі нағыз клеткаға айналады. Электрондык микроскоп көрсеткендей, Уісіа һаіазіапа протопластарынын сырткы кабатын-да 10-20 минут откен сон бірінші целлюлозанын микрофибриль-дері пайда болады, ал 20 сағаттан кейін олар кабыктын тығыз торын түзеді. Клетка кабығынын плазмалеммамен байланысынын бүзылуы, шамасы, бірден кабыкты кайта күру механизмін іске косады. Ен кызығы, кабығынан айырылмаған плазмолизге үшыраған протопластын үстінде жана кабыктын түзілгені. Қабыктын түзілуінін ерекшеліктері және жылдамдығы бастапкы клетканың түріне және дифференцировкасына байланысты.

Алка, крестгүлділер, шатыршагүлділер түкымдастар осімдіктерінін протопластары клетка кабығын 24 сағат ішінде түзеді. 24-36 сағаттан кейін клеткалар бірінші рет бөлінеді, ал 3-4 апта өткен соң каллус клеткаларынын колониясы түзіледі. Өсіру кезінде біртіндеп (2 аптадан кейін) ортанын осмостык кысымын төмендетеді, сонын нәтижесінде боліну жылдамдығы оседі. Содан кейін каллустарДы регенерация оту үшін катты ортаға кешіреді. Каллуста морфогенездін (органогенез) басталуы, яғни өркен мен тамырлар түзілуі регенерант өсімдіктер пайда болуына әкеледі (38-сурет).

Талай есімдіктердін протопластары сомалык эмбриогенез аркылы да регенерант өсімдіктер түзеді. Окшауланған аркасында, олар тесіліп, кейін тез бөлініп, жаксы тамырланған регенеранттарды берген. Бірак электроөндеудін протопластардағы морфогенез процестерін арттыру және жылдамдату механизмдері белгісіз. Мүмкін, ол мембраналарға әсер етіп, фитогормондарды сініруін күшейтеді, немесе ДНК синтезін арттырады. Сонымен катар, протопластарды агарозасы бар байытылған коректік ортаға отырғызу алдында жылумен әсер еткенде, олардьщ кейін бөліну каркындылығы арта түскен.

Әр түрлі өсімдіктердін протопластарын бөліп алып, іп ұііго өсіруіне арналған орасан көп макалалар ғалымдардын бүл мәселеге ерекше назар аударатынын дәлелдейді.

8.5. Протопластардын бір-бірімен күйылысып қосылуы

Өсімдіктердін клеткалык инженериясы деген термин кең мағыналы түсінікті камтиды. Бүнын бір мәні - протопластардын бір-бірімен күйылысып косылуы негізінде жасалатын биотехнологиялык тәсілдер жүйесі. Протопластар күйылысканда алдымен олар бір-біріне тоғысып жабысады, оны агглютинация деп атайды. Содан кейін олардын мембраналары да косылып, екі протопластан үлкен бір протопласт пайда болады. Протопластардын күйылысу механизмі түсініксіз, әсіресе мембраналардын күйылысуы. Протопластардын өзінен-өзі күйылысуы өте сирек күбылыс, ол екі протопласт арасында плазмодесмалардын кездейсок калуынан бола алады.

Протопластардын сыртында теріс электр заряды болады, сондыктан олар суспензияда бір-бірінен окшауланады. Қүйылысу үшін оларды алдымен бір-бірімен жанастыру керек, сондыктан плазмалемма зарядын өзгерту кажет. Протопластардың күйы-лысуы үшін химиялык және электрлік әдістері пайдаланылады.

Химиялык әдіс протопластардын күйылысуына жағдай жасайтын, плазмалемманың электрлік зарядын өзгертетін заттарды суспензияға косуға негізделген. Э. Кокинг томат тамырынын меристемасынан алынған протопластарды косу үшін нитраттарды (көбінесе 1Ча>Ю₃) пайдаланған. Бірак косылған протопластар аз болған және олар жиі закымданған. Протопластын сыртында теріс зарядты жою үшін сілтілі ортада (рН=10,5) 50мМ СаС1₂ қолданылған. Ю-15 минуттан кейін Са²⁺ жоғары мөлшерде (100-^ЖІ М) ^баР сілтілі (рН 9-11) ерітіндімен ПЭГ-ты суспензиядан 3^.^М _п шығарады. Сонан сон протопластарды бір-бірімен ш^^ь _ырып түрған мембраналар күйылыса бастайды. Осындай *Кр - сілтілі рН - мөлшері жоғары Са²⁺» әдістемесі казір дүние

нйС көптеген лабораторияларда колданылады Мүмкін ПЭГ су ортасынын полярлығын төмендетеді,сонын нәтижесінде мембрананын полярлык және гидрофобтык компо-ненттері кайта бөлініп, липидтік күрылымдары түракталады. ПЭГ-тін әсерімен мембрана көп жерден тесіледі. Протопластар бір-бірімен жабыскан кезде, сол тесіктер аркылы олардың ішіндегі заттар ары-бері өтеді. Протопластар косылғаннан кейін де, ен бастапкы кезенде мембраналардағы тесіктер бітелмейді. Прото-пластар әбден толығымен косылған сон ғана олардын мембрана-лары күйылысып жалпы ортак бір толык плазмалемма будан протопласты коршайды. Акырында протопластар донгеленіп будан протопласт пайда болады (39 г).

Бүл әдістің өз кемшіліктері бар. ПЭГ-мен өндеу нәтижесінде протопластардын көбі закымданып күриды. Егер екеу емес, одан да көп протопластар косылса, олар тіршілікке икемсіз келеді.

коздырады, протопластар бір-біріне такалып бір катарға тізіледі (40 б). Бүл тізбектер тек электр өрісі болған кезде түрады. Оларға косымша жеке катты электр импульсін (600 В/см, 10-20 мкс) бергенде, катты кысылып түрған плазмалык мембраналарда тесіктер пайда болады да (40 в), протопластар бір-біріне күйылып кетеді. Басылып бара жаткан айнымалы электр сигналы цитоплазмалар араласып жатканда, протопластарды біріктіріп үстап түрады (40 г). Электр тогын өшірген соң косылған протопластар донгелектенеді (40 д). Электр орісінін әсерінен протопластар бөлме температурасында және рН-тын физиологиялык мөлшерінде нәтижелі косылады. Кыска катты импульс мембранаға кысым жасап, протопласт плазмалеммалары косылып түрған жерде диэлектрлік бүзылуға себеп болады. Өзгеріліп түрған электр өрісі мембрана белоктарының латеральдік диффузиясына апарады, сонын аркасында белоктары жок мембрананын учаскелері пайда болады. Сондай кезде карама-карсы түрған протопластар мембраналары әрекеттесуі мүмкін. Бүнда липид молекулаларымен алмасу, липид көпірлері пайда болуы мумкін, акырында мембраналар күйылысады. Электр өрісі комегімен әр түрлі үлпалардын және өсімдіктер түрлерінін протопластары косылады.

X. Борнман әріптестерімен бірге рапс протопластарында химиялык және электрлік әдістерінің салыстырмалы зерттеуін откізді. Алынған нәтижелері бойынша мынадай корытындыға келді. Косу жолының екеуі де мембраналардын гидрофобтык бөлігінін бірдей озгерістеріне және компоненттерінін бірдей түраксыздануына әкеліп соғады. Бірак ПЭГ-мен өнделген протопластардын өткізгіштігі артык болған. Себебі ПЭГ дегидратапиялау әсері арқылы протопластардың барлык бетінде кездейсок тесіктерді пайда болғызады. Бірак кейбір тесіктері тым улкен болғандыктан мембраналар тез оз калпына түсе алмайды. Электр әдісі кымбат жабдыкты талап етеді, сондыктан ғалымдардын көбі химиялык әдісті қолданады.

Протопластардын косылуы - бүл кездейсок күбылыс, оған кептеген факторлар әсер етеді. Күйылысу жиілігі есімдіктін түріне емес, клетканын ультракүрылымына байланысты. Мысалы, меристемалык және каллустык протопластар онай күйылысады, ал вакуолі үлкен және хлоропластары дамыған протопластардын косылуы киын. Алайда, түр ерекшелігін есепке алмауға болмайды. Мысалы, сәбіз, картоп, арабидопсис протопластары темекіге карағанда жаксы кұйылысады. Даражарнакты өсімдіктердін протопластары косжарнактылармен салыстырғанда онай кұйылысады.

Инженерия деген термин күрастыру деген мағынаны білдіреді. Клеткалык инженерия әдістеріне протопластарды косып будандастырудан баска, клеткалардын хеке бөліктерінен оларды кайта қүрастыру да (реконструкция) жатады. Клеткаларға оқшауланған баска клеткалык органеллаларды (ядро, хлоропластар, митохондриялар) енгізу аркылы генетикалык жүйені кайта күру мүмкіндігі ғалымдардың назарын аударады. Себебі осы әдіспен цитоплазмалык геномда жазылған касиеттерді бір клеткадан баска клеткаға ендіріп, күнды өсімдік формаларын шығаруға болады. Мысалы, жоғары активті хлоропластарды енгізуі фотосинтездін каркындылығын арттырып, өсімдіктің өнімділігін көтереді. Гербицидтерге шыдамдылықты, кейбір ауруларға иммунитетті және токсиндерге реакциянын белгілері хлоро-пластык ДНК-да жазылады. Ал митохондриялык ДНҚ-да цитоплазмалык аталык стерильдік белгісі жазылады. Протопластарға сондай белгісі бар митохондрияларды енгізу аркылы өсімдікке осы бағалы касиетті тән етуге болады.

Клеткаларға іп уііго жағдайында органоидтерді тасымалдау -назар аударатын тәсіл, бірак, өкінішке орай, онын әдістемелік жағы жаксы зерттелмеген. Әдетте ғалымдар протопластарды органоидтар суспензиясымен араластырып, мембраналарға әсер ететін заттарды косып, центрифугалайды. Бірак протопластарға органоидтардың бірлі-жарымы ғана енеді.

Бірінші рет будан клеткалары 1960-шы жылдары клеткаларды іп уііго өсіру әдісі жетілдірілгенде жануар клеткаларынан алынған. Өсімдіктерде бүл мүмкіншілік кешірек, протопластарды бөліп алу және оларды косу әдістері жете зерттелгенде жүзеге асты.

Жануар сомалык клеткаларын будандастыру әдісі биология мен медицинаның теориялык мәселелерін шешуге пайдаланылады. Будан клеткалар биотехнологияда кеңінен колданылады, мысалы, гибридомаларды пайдаланып моноклондык антиденелерді алу үшін. Гибридома деген ол антидене түзетін клетканын (В-лимфоциттің) ісік клеткамен косылған будан клеткасы. «Ома» деген жұрнак, ісік клеткасы үғымды білдіреді, яғни гибридома ісік клеткасымен баска клетканы будандастыру аркылы алынған будан клетка. Неліктен гибридома жасау үшін ісік клеткалары колданылады? Себебі ісік клеткалары тез және үздіксіз бөлінеді. Пайдалы зат түзетін баска клеткаларды (мысалы лимфоциттер) ісік клеткасымен будандастырғанда алынған гибридомаларды биотехнологиялык әдістермен ферментерларда өсіріп, кажетті пайдалы заттарды мол өндіруге болады. Ісік клеткаларынын күрамына енгізілген лимфоциттер организмнен тыс шексіз уакыт өсіп, антиденелерді түзеп, оларды коректік ортаға мол мөлшерде шығарып жатады. Кейін осы антиденелерді бөліп алып, тазалап, медицинада пайдаланады.

Өсімдіктердің сомалык клеткаларынын протопластары күйылысып, будан клетка күрылады, ал одан тотипотенттік касиетке сүйене регенерация аркылы будан организм шығады. Сондыктан бүл әдіс будан өсімдіктін кұрамында нендей касиеттердін пайда болатынын білу үшін генетикалык талдау жасауға ынғайлы. Сомалык клеткаларын будандастыру аркылы өсімдіктерді генетика жағынан жаксартуға болады.

Көне заманнан бастап мәдени өсімдіктердін селекциясы жыныстык будандастыруға және соның нәтижесінде шыккан алуан генотиптерді сүрыптап, олардың арасынан ен күндыларын таңдап алуға негізделген. Бірак жыныстык будандастыру генетикалыкжағынан өте катан шектелген будандастыру жүйесі. Бүнда ата-аналык формалары ретінде тек биологиялык бір түрге жататын белгілі организмдер белгілі бір тіркесте пайдаланылады. Жыныстык будандастырудың нәтижесінде белгілі гендер жиынтығы бар ұрпак пайда болады. Жыныстык жолмен мәдени өсімдікке жабайы түрдін бағалы жеке бір ғана белгісін беру мүмкін емес. Жыныстык процесс симметриялык (аталык пен аналыктан Үрпакка несие боп берілетін хромосомалар саны тепе-тен) болғандыктан, көздеген максат бойынша берілетін пайдалы касиетпен катарласып, көптеген тіпті зиянды белгілері де косымша беріледі. Аталык пен аналыктын екеуінің де гаметалары спектрлері) топтасып жойылады. Екіншісі, жоғарьі сатыдағы өсімдіктердщ мхДНК гетерогендік болғандыктан будан клетка бөлшгенде мхДНК бүрын ата-аналарда білшбеген минорлык фракциясы басьш бөлініп, көріне бастаиды. 1) сомалык будандарда пластом белплері толык косегрегацияға үшырайды; 2) шіастомнын генетикалык рекомбинациясы эте сирек кездеседі; 3) митохондриялык ДНҚ рекомбинанттык түрі от? жиі кездеседі; 4) митохондрионньгя пластомға іцшп бетімен сегрегациясы оте береді. Сонымен, сомалык будандас-тыруда мхДНК езгеруі хпДНК елеулі аиырмашылығы яғни жыныстык пропесіне карама-карсы, мхДНК әжептәуір өзгерістерге тап болады. Неше клетка косылғанын аныктау үшін сомалык будандардың хромосомалык санын есептейді. Мысалы Г. Мельхерс пен Г. Лабиб жоғарыда айтып кеткен темекінін гаплоидтык протопластарымен өткізген тәжірибесінде 63 жасыл регенерант арасында 18 үшплоидтык өсімдікті тапты. Ю.Ю. Глеба темекінін диплоидтык клеткаларын будандастырып, 9 регенерант ішінде біреуі гексаплоидтык болып шыккан. О. Шидер сасыкмендуананың түраралык сомалык будандарымен мүкият откізілген эксперименттерінде үш және одан астам клеткалардың косылғанын аныктаған. Бірак мүндай будандар зерттелмеген, сондыктан олардын ядролык және цитоплазмалык гендерінін тағдыры белгісіз.

Сойтіп, сомалык будандардың жыныстык будандардан айырмашылығы, олардын көп озгергіштігі. Сомалык будандарда байкалатын фенотиптік озгергіштік регенерация процесі басталмастан бүрын отетін генетикалык күбылыстардын нәтижесі. Д. Эванс пен Е. Фликс бойынша, езгергіштік себебі мынада: 1) ядролык сыйымсыздык; 2) митоздык рекомбинация; 3) органоидтардың белгілерінін ажырауы; 4) сомаклондык өзгергіштік.

Корытындысында, ерекше кеңіл аударатын жағдай, сомалык будандарда өтетін генетикалык процестер өте аз зерттелген. Сондыктан, ол процестердің керек бағытта отуін кадағалап реттеу әзірше мумкін емес.Жат текті түрлерді сомалык будандастыруЭр килы түкымдастар, трибалар (түкымдас пен туыс аралығын-дағы жүйелеу бірлігі) және туыстар қүрамына кіретін бір-біріне жат түрлер арасында жыныстык жолмен будан алу мүмкін емес. Филогенезде түпкі тектері алшак жаткан түрлер арасынан тек сомалык буданды, олардын протопластарын косып алуға болады. Бірак осы кезге шейін ондай сомалык будаңдардан күнды үрпакты өеімдіктер әлі алынған жок. Мысалы, ғалымдар мынадай түкымдасаралык будан клеткалардан линиялар алған: соя мен темекінің әр турлерінін каллус пен мезофилл протопластарын косып; бүршак пен темекінін; ат бүршағы мен темекінін; темекі мен пияздын және т.с.с. Осы түкымдасаралык клеткалык будандардын клондары зерттелді. Барлығында кыска мерзімде мезофилл клеткасынын хромосомалары жойыла бастаған. Цитогенетикалык талдау мен изоферменттердің күрамын талдау көрсеткендей, хромосомалар толыкжойылмаған. Түкымдасаралык будан клеткалар арасында көпядролык немесе өте кіші клеткалар, хромосомалык кайта күру, алып хромосомалар көп байқалған. Тек темекі мен ат бүршағы арасындағы будан клеткаларда морфогенез индукциялау аркасында сабакка үксас кемтар күрылымдар пайда болған. Бір түкымдаска карайтын түрлердін будандарын алғанда, яғни трибааралык және туысаралык будандармен өткізген тәжірибелердін нәтижесі жөндірек болған. Бүндай будандар алка, крестгүлдер және шатыршагүлділер түкымдастарында алынған.

1978 жылы Ю. Ю. Глеба мен Ф. Хофман арабидопсистын каллус протопластарын турнепстың мезофилл протоплас-тарымен косып сомалык будан алды. Бүл өсімдіктер крестгүлділер түкымдасынын әр түрлі трибаларына жатады. Будан клеткалар линияларында цитологиялык талдау көрсеткендей, екі түрдің де хромосомалары жойылмаған, дегенмен хромосомаларда кайта күру өткен. Клеткалардын екі линиясында морфогенез жүргізіліп, регенерант өсімдіктері алынған. Олар морфология жағынан арабидопсиске де, турнепске де үксас болған. Бірак бүл нормалы өсімдіктер емес еді, олар гүлдеген жок. Цитологиялык, биохимиялык және морфологиялык талдау өткізгенде, будан өсімдіктерде екі түрдін де генетикалык материалы болғаны дәлелденді. Ал арабидопсис пен турнепстін іп уііго жағдайында өсірілген клеткаларынан сабактар шыккан жок. Бүл өте кызык кұбылыс. Будан клеткаларында морфогенез бен регенерация өткені морфогенездік кабілетінін калпына келуін дәлелдейді.

Сомалык будандастыру жолымен сасыкмендуана мен итжидек (красавка), итжидек пен кытай темекісі, итжидек пен бежір (сныть), итжидек пен шырайгүлдін (петуния) арасында трибааралык будандар алынған. Бүл жүмыстардың манызды нәтижесі, олар филогенезде түпкі тектері алыс өсімдіктердін будан клеткаларынын морфогенездік активтігін көрсетеді. Сонымен бірге морфогенезге кабілеттілік ата-аналардың біреуінін генетикалык материалынын жойылуымен байланыспаған.

Туысаралык сомалык будандар арасында ең кызығы картоп пен томат буданы. Оны 1978 жылы бірінші болып Г. Мельхерс шығарды, кейін баска ғалымдар да алды. Регенерант осімдіктерінде (помато, томафель) ядролык материалы буданды болды, бірак олар үрпаксыз еді. Жапон ғалымдары үлкен табыска жеткен, олар астык тұкымдастардын әр түрлі туыстарына жататын күріш пен тарының сомалык будандарын алған, онда екі тұрдін де белгілері болған. Әсіресе кызыктыратын жағдай, бүл даражарнактыларға жататын өсімдіктер.

Жоғарыда сипатталған эксперименттерде алынған барлык өсімдіктер аномальды болғандыктан олар тек теориялык түрғыдан ғана манызды. Филогенезде түпкі тегі алыс өсімдіктер түрлерін будандастыру тіршілік негізінде жаткан процестерді зерттеуге мүмкіншілік береді. Тек кана сомалык будандастыруды пайдаланып, клетканын бөлінуі, сол кездегі генетикалык материалдын ұйымдасуы және морфогенез жөнінде бірталай мәселелерді эксперимент түрінде шешуге болды. Сонымен бірге, кейбір кезде түкымдасаралык будандар ата-аналардын біреуінін хромосомалары түсіп калуы аркасында асимметриялык будан болып шығады. Оларды селекцияда жеке хромосомаларды немесе хромосома бөліктерін алыс туыс түрлер арасында тасымалдау үшін пайдалануға болады.

ПЭГ кайсы клеткалар косылса да әмбебап фюзоген болғандыктан жануар клеткалары мен өсімдіктер клеткаларын косу тәжірибелері өткізілген. Олардын кұйылыскан клеткалары бірнеше кұн тіршілікке икемді болған, тіпті кейде ядролары косылып, клетка кабығы да түзілген. Мысалы, адамның ісік клеткалары Неіа темекінің мезофилл протопластарымен, сәбіздін, гаплопаппус протопластарымен косылған, адамның лимфопиттері темекінің мезофилл протопластарымен, амфибия клеткалары сәбіз протопластарымен күйылыскан.

Сонда осы тәжірибелердін максаты кандай? Әрине тек кана пайдалы будан организм алу үшін ғана емес. Бүл эксперимент-тердін теориялык манызы зор. Жануарлар мен өсімдіктердін эукариот клеткаларын толығырак зерттеуге мүмкіншілік береді, олардың будан клеткалары бөліне алатын жағдайды аныктауға, ^жануар клеткалардан өсімдік клеткаларына гендерді көшіру ^мҮмкіншілігін және баска да күрделі мәселелерді зерттеуге көмектеседі.

Сомалык будандарды сүрытал алу әдістері

Жеке гетерокариондар мен будан протопластарды көптеген ата-аналык протопластардын арасъшан сүрыптап алу киын міндет. Сондыктан алғашында зерттеушілер будандарды регенеранттар пайда болғанда мутациялардын комплементарлығы негізінде іріктеген. Г. Мелъхерс пен Г. Лабиб 1974 жылы алынған өсімдіктерінін нағыз сомалык будан екендігін дәлелдеу үшін генетикалык комплементтенуді колданды. Генетикалык комплементтену - ол будан клеткаларда гендер әрекеттесу негізінде акауы бар гендердін функциясын калпьюа кайтадан келтіруі. Ата-ана ретінде №соиапа ІаЪасит екі сортын колданды. Олардын жарыкка сезімтал хлоропластары болған. Әрбір сорттын ядросында жарықка сезімталдыкты белгілейтін өзінін рецессивтік гені болған (V мен з). Сол гендердін салдарынан бүл өсімдіктер жарыкта өскен кезде хлорофилл түзілуі кемтар болған. Осы гендер бойынша гомозиготалык өсімдіктер күшті жарыкта өсіргенде, жапырактары түссізденіп, акыръшда күрыған. Ал жыныстык будандардын хлоропластары дүрыс түзіліп, жапырактары жасыл болған, себебі мутацияға үшыраған акау гендер жыныстык процесс кезінде комплементтеніп кеткен. Екі сорттын гаплоидтык протопластары косылғанда да дәл сондай нәтижеге жеткен. Бүл тәжірибе бірнеше сатыдан түрған (43-сурет).

Алдымен тозанкаптарды өсіріп гаплоидтык өсімдіктер алынған. Бүл өсімдіктер жарыкта емес, көленкеде өсірілген. Сондыктан жапырактары жасыл болған, сәуле түспеген сон олардын мутацияға душар болған гендері өздерінін активтігін көрсете алмаған. Олардъщ жапырактарынан протопластар бөлініп алынған. Протопластарды косып, будан клеткалар жасалған. Ол клеткаларды колониялар және каллустар пайда болғанша өсірген. Каллустарды жаңа ортаға көшіріп, морфогенез процесін жүргізген. Сонда каллустардан сабактар шыккан. Одан соң жарыкта (10000 лк) өсіре бастаған. Бүл жағдайда хлорофилл түзіп жасыл өскіндері болып, тірі калған тек кана сомалык будан өсімдіктер ғана. Ал будан емес өскіндер акшыл болған, акырында күрыған.

Сол сиякты баска тәжірибелер де өткізілген. Оларда фотосинтездік мутанттардын генетикалык комплементтенуін №согіапа мен Оагига будандарын алу үшін пайдаланған. Хлоропласт гендерінін күрамында мутацияға душар болған хлорофилл түзуге жауапты гендер мәдени өсімдіктерде кен тараған. Сондыктан сол гендерге негізделген генетикалык комплементгену әдісі сомалык будандарды алудын ен сенімді және карапайым жолы. Бұл мутанттармен өткізілген жүмыстардын артыкшылығы, цитоплазмалык будандар мен цитоплазмалык гетерозиготаларды аныктау мүмкіндігі. Бірак бүл әдіс көп уакытты талап етеді, себебі сүрыптау тек кана регенерант өсімдіктер денгейінде жүргізіледі.

Хлорофилдік мутанттардан баска мутанттар да сомалык будандарды сүрыптау үшін колданылады, мысалы, ауксотрофтык мутанттар. Ауксотрофтар - бүл биохимиялык мутанттар. Олар мутация саддарынан өз тіршілігіне кажетті кандай да бір заттың биосинтезіне кабілеттілігінен айырылған. Сондыктан ауксо-трофтык клеткалар сол өздері түзе алмайтын заттың коректік ортада болуына мүктаж. Мысалы, О. Шидер бауырмүкті глюкозаға ауксотрофтык аталык штамынын протопластарын, никотин кышкылына ауксотрофтык аналык штамынын прото-пластарымен косьщ, будан клеткаларын бөліп алған. Бүл сомалык будан клеткалары ауксотрофтык болмаған. Оның себебі неде? Сүрыптау калай жүргізілген? Бүл күбылыска мынадай түсінік беруге болады. Бауырмүктің аталык штамынын клеткасындағы глюкоза түзуге катынасты ген мутацияға үшыраған, бірак онын никотин кышкылын түзуге жауапты гені ешкандай өзгеріссіз, өз күшінде калған. Керісінше, аналык штамының клеткасындағы никотин кышкылын түзуге жауапты гені мутацияға үшыраған, ал глюкоза түзуге катынасты ген мутацияға душар болмай, өз кабілетін сактаған. Әркайсысынын өзіндік акауы бар осы екі штамнын протопластарын косып будан клеткалар алынғанда, оларда глюкозаны да, никотин кышкылын да түзуге касиет пайда болады. Сөйтіп, ауксотрофтык акаулык жойылған.

Будан клеткаларды сүрыптаудын тағы бір әдісі, ол физиологиялык комплементтену. Кейде ата-аналык ретінде колданылған клеткалардың көбеюге және морфогенезге кабілеті болмайды, ал олардын протопластарын косудан пайда болған сомалык будан клеткалар ондай кабілет көрсете алады. Бүл генетикалык емес, физиологиялык күбылыс. Себебі, ата-аналык клеткалардың акаулығы кандай да болсын мутацияларға байланысты емес. Будан клеткалардын көбеюге және Морфогенезге кабілеттілігінін калпына келуі олардын сырткы ^ағдайға нормалы физиологиялык реакциясы. Бірінші болып І972 жылы бүл әдісті табысты колданған П.Карлсон. Ол №соііапа Ііаиса мен ]Ч.1ап§8СІогпі түраралык сомалык буданын алды. Бүл іурлер арасынан жыныстык будандар бүрын алынған еді және Олардың клеткалары іп уііго өсіргенде ауксинді кажет етпеген. Ал, керісінше, ата-аналык ретінде колданылған бүл екі түрдің Ютеткалары іи ұііго жағдайында коректік ортаға ауксинді коспаса ®се алмаған. Осы екі түрдін мезофилл протопластарын косып, ауксині жок ортада өсірген. Бүндай коректік ортада тек кана Сомалык будан клеткалар ғана өсе алған.Э. Кокинг физиологиялык комплементтенуді колдану үшін Мына тәсілді үсынған. Алдымен ата-аналык ретінде алынған Клеткалар іп уііго өсіріліп, олардын біріне колайлы, ал баскасына Колайсыз коректік ортанын күрамы аныкталады. Олардын Чротопластарын коскан сон, клеткаларды кезекпен сол коректік орталарда өсіреді. Соның нәтижесінде аталык немесе аналык Кгіеткалар өздеріне колайсыз ортада күриды, ал сомалык будан •счеткалар көбейіп, өсе береді.Физиологиялык комплементтенуді колдану үшін зерттелу Өткізілмеген кезде, генетикалык маркерлері болмағанда, баска *дісті колдануға болады. Ол үшін протопластарды күйылысу Элдында, метаболизмді тежейтін улы заттармен өңдейді. Екінші ^сімдіктін протогіластарын баска улы заттармен өңдейді. Осындай 'іротопластар күйылысып, будан клеткалар пайда болғанда Олардың метаболизмі жөніне келеді, яғни биохимиялык ^омшіементтену өтеді. Косу үшін алынған протопластардын **Ктивтігін тежеу үшін оларды улы заттармен ғана емес, әр түрлі вәулелермен де (ультракүлгін, гамма, рентген) өңдеуге болады.

Бірак Э. Кокингтің пікірі бойынша, комплементтену негізіндегі ^сҮрыптау әдістерінін кемшілігі бар. Бүл әдістерді колданғанда, іек кана амфидиплоидтык сомалык будандар тірі калады. Олардын «'расында, мүмкін, күнды асимметриялык будандар (бір ата-^Наның толык геномы, екіншісінің - бөлігі) алынбай калады. Сондыктан, ең тиімдісі олардын әркайсысын механикалык ^Діспен кадағалап көріп отырып, колмен шеберлікпен іріктеп ^гу. Ол үшін алдымен будан клеткаларға тән белгіні аныктап алу ^ерек. Мысалы, инверттік микроскоп пен микроманипуляторды колдана отырып, мезофилл протопластары (пластидтері жасыл, цитоплазмасы аз, вакуолі үлкен) мен каллус протопластары (цитоплазмасы көп, онын ядросы жаксы көрінеді) косылудан пайда болған клетканы бөліп алуға болады. Бүл әдістін артыкшылығы - мутанттарды немесе алдын ала өсіру жағдайларын зерттеуді кажет етпейді.Протопластарда көзге көрінетін табиғи маркерлары болмаса, оларды косар алдында флуоресценттік заттармен бояйды. Протопластардын әр түрін флуоресценциясы әр түрлі заттармен бояйды. Бір клеткада екі түсті флуоресценциясы болғаны, оның будандык күрылымына дәлел.

Клеткаларды сүрыптаудын механикалык әдісінің де өз кемшілігі бар, сондыктан ол жиі пайдаланылмайды. Бүл әдіс көбінесе каллус клеткаларының протопластарына колданылады, өйткені оларды жекелеп өсіру онайырак. Будан клеткаларды бөліп алу және кейін микротамшыда өсіру, бір клеткадан тараған үрпактар алуға, яғни клетканы клондауға мүмкіндік береді. Клондау будан өсімдіктің белгілі бір жеке протопластан шыккандығына кепіл болады.

Сонымен, будан клеткаларын сүрыптау әдістері біршама, бірак олардын әркайсысы әжептәуір еңбекті талап етеді. Сондыктан Кооп және Швейгер зерттеп дайындаған әдіс тиімді көрінеді. Алдын ала іріктеп алынған, косылуға арналған екі протопласты әйнектін үстіне күйылған минералдык майдын тамшысына салады. Электр күшімен косу үшін электродтарды инверттік микроскоптын конденсорына бекітеді. Конденсорды көтеріп немесе түсіріп жылжыта отырып, электродтарды тамшыға енгізеді немесе одан шығарады. Электр импульсты берген сон, микроскоп аркылы протопластардың косылуын бакылайды. Сонан сон косылған клетканы байытылған коректік ортаның микротам-шысында жеке өсіреді.

Будан өсімдіктерді талдау әдістері

Протопластардьш косылып будан клетканын пайда болғанын бірнеше әдістермен тексеріп, дәлелдеуге болады. Ол үшін генети-калык және биохимиялык талдаулар өткізеді. Будандастырулык талдау (гибридологический анализ) генетикалык әдістеріне жатады. Ол үшін нактылы касиеттерін ескере отырып, арнайы тандап алынған есімдік формаларын бір-бірімен будандастыру нәтижесінде тараған үрпактардын фенотиптік белгілерінін бастапкы аталык пен аналыктан каншама ауыткып, өзгеріске ұшырағандығын статистикалык есептеу аркылы біледі. Егер сомалык будандастыру үшін рецессивтік мутанттар кодданылса, онда будан клеткада ол мутациялар жасырын түрінде калады. Ал алынған будан өсімдік кейін өз тозанымен өзі үрыктанса (жыныстык көбею) одан шыккан Ғ, үрпак фенотипінде мутаииялар кайта жанғырады. Осылай өткізілген талдау, шыккан өсімдіктердін будандык табиғатын дәлелдейді. Бірак сомалык будандардын ядролык гендерінің оңдай өсімдіктер жыныстык будандастыру жолына түскен кездегі күй-жайы әзірше өте нашар зерттелген.

Көбінесе сомалык будандар цитогенетикалық таддауға түседі, яғни хромосомаларының күрылымы мен саны зерттеледі. Бүл әдіс әсіресе алыс туыстардын (трибааралык, түкымдасаралык) будандарына колайлы. Себебі олардың шығу тегіндегі аталык пен аналык өсімдіктердін хромосомалары арасында әжептәуір айырмашылығы бар. Егер будандаскан түрлердін хромосомалары морфологая жағынан үксас болса, онда оларды дәлірек айкындау үшін дифференциялды бояу әдісі колданылады. Бүл әдіс хромосомалардын әрбір гомологиялык жүбына тән ерекше сызыктарын аныктайды. Бірак цитогенетикалық талдау ылғи бірдей сенімді бола бермейді, өйткені іп ұііго өскен клеткалардың хромосомалары ете жиі өзгеріске үшырайды. Көптеген зерттеушілер биохимиялык тадцау әдістерін кеңінен пайдаланады, әсіресе түраралык будандар үшін. Полиакриламид гелінде электрофорезді жүргізіп, одан кейін белгілі ферменттік активтігі бар белоктарды бояу аркылы изоферменттерді зерттеу -биохимиялык талдау әдістерінін ең карапайымы және тиімдісі. Әдетте сомалык будандардың пероксидаза, эстераза, малат-дегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, алкогольдегидро-геназа, лактатдегидрогеназа, амилаза т.б. ферменттердін изофер-менттік спектрлері зерттеледі.

Парасексуальдык будандарды биохимиялык талдаудын ен бір сенімді және онай әдісі, ол РуБФК ферментін зерттеу. РуБФК -ен көп тараған және ен жаксы зерттелген осімдіктер белогы. Ол фотосинтездегі Кальвин циклінін ен маңызды ферменті.үлкен және 8 кіші бөлшектерден түрады. Үлкен бөлшектердін полипептидтер күрамы хлоропластык ДНК бойыңца генетикалык кодпен жазылады, ал кішкенелердікінін - ядролык ДНК. бойында. Полиакриламид гелінде изоэлектрофокустау әдісімен бөлшектерінің полипептидтік күрамын зерттеу аркылы әр түрлі өсімдіктердін ферментінің полипептидтерінін күрылымындағы айырмашылыктарын аныктауға болады. Осындай талдау буданнын шығу тегін зерттеу үшін біркатар түраралык парасексуальдык будандарда өткізілген. Сонымен бірге РуБФК-нын талдауы ядродан тыс орналаскан гендерді зерттеу үшін де колданылады.

Осы максатпен будандар мен ата-аналарының хлоропластык ДНҚ және митохондриялык ДНҚ бөлініп алынып зерттеледі. Ол үшін ДНК нуклеазалармен өнделеді. Ол ферменттер ДНК-ны әр түрлі ерекше жерінен үзеді, ыдыратады. Кесілген ДНК фрагментт-ерін электрофорезбен талдағанда, түріне тән ерекшелігі айкында-лады. Сөйтіп, оны буданнын және ата-аналардын органоидтарын зерттеу үшін колданып, олардың табиғатын аныктауға болады. Сомалык будандарды талдау үшін нуклеин кышкылдарын