Коректік ортадағы фитогормондар - клеткаларда негізгі және косымша заттардын алмасуын нәтижелі реттейтін манызды фактор

М. Ценк кызметтестерімен ауксин активтілігі бар 146 химиялык коспалардын мориңца (Могіпда сіггһоііа) клеткалары-ның өсуіне және антрахинон түзілуіне әсерін зерттеген. Сол химиялык заттардың көбі клеткалардын жаксы өсуіне ыкпал еткен. Ал тек кана екеуі - а-нафтилсірке кышкылы мен 2,3,6-үшхлорбензой кышкылы - клеткалардың өсуі мен бірге оларда антрахиноннын синтезіне де жаксы ыкпал еткен.

Кен колданылатын ауксин - 2,4-Д. Ол клеткалардын бөлінуіне де, созылып өсуіне де себепші бола алады. Бірак ол косымша метаболизмнін өнімдерінің синтезін шүғьш басып тастауы мүмкін. Ауксин мен цитокининнің типі мен концентрациясын өзгерте отырып, әрбір нактылы клеткаларда кажетті заттын синтезіне жаксы ыкпал етуге болады.

Көмірсулар - биомассанын көбеюіне әсер ететін коректік ортанын манызды факторынын бірі. Клеткалар іп уігго жағдайында гетеротрофты болғандыктан, көміртегі көзі ретінде сахароза пайдаланылады. Сахароза мен бірге кейде глюкоза да пайдаланылады. Сахарозаның көтерінкі концентрациясы косымша заттардың артык шығуына ыкпал етеді. Сонымен бірге сахарозаның жоғары концентрациясы коректік ортанын осмос потенциалын арттырады. Сахарозаның ортаға көп косылуы әлбетте өндірісті кымбаттатады, сондыктан арзан көмірсулар іздеп табу биотехнологиянын өзекті міндетінің бірі.

Қосымша заттардын синтезіне коректік ортаның минераддык күрамы үлкен ыкпал етеді. Олардын арасында ен мәнділері азот, фосфор және калий. Бірак олардын әсерінін өсімдік түріне және өнімге байланысты ерекшеліктері бар. Мысалы, бір клеткаларда азоттын органикалык формалары (пептон, ашыткы экстракты, казеин гидролизаты) косымша заттардын корлануын тежейтін болса, баскаларында керісінше синтезін арттырады.

Аммоний және нитраттык азоттын ара катысы да әсер етеді. Мысалы, диоскорея клеткаларын өсіргенде ортада нитраттык азоттын мөлшерін көбейткенде, диосгениннін синтезі артатүскен. Темекі клеткаларын өсірген ортада сахароза, нитрат және фосфордың мөлшерін азайтканда, оларда никотин синтезі арта түскен. Адыраспан клеткаларын фосфоры жок ортада өсіргенде, оларда алкалоидтардын және баска косымша заттардың мөлшері өскен. Фосфордың жетіспеушілігі кейбір баска клеткаларда да косымша заттардың синтезін арттыра түскен. Бүта бүрыштын каллус клеткаларында нитраты жок ортада капсаициннің синтезі

көтерілген. Кажетгі өнімдердін кейбір алғы заттары олардын биосинтезіне дүрыс әсер етеді. Мысалы, шамалы коректік ортада үзак өсірген клеткаларға кажетті заттын алғы косылыстарын бергенде, олар керек өнімнін синтезін жаксартады. Алғы заттар ретінде амин кышкылдары (глутамат, фенилаланин, лейцин, орнитинт.б.) мен органикалык кышкылдары (ацетат, сукцинат, шикимат т.б.) алынады. Сонында олардан әр түрлі күрделі заттар түзіледі.

Бірак каллус үлпалары оларды пайдаланбауы да кездеседі. Үміт еткен эффекттін байкалмағанын әр түрлі түсінуге болады. Бәлки, ол алғы заттарды ортаға коскан уакытына байланысты. Мүмкін клеткалар оларды өздері синтездейді, сондықтан ортадан сініріп алмайды. Ыктимал ортаны стерильдеген кезде олар ыдырап кетеді немесе физиологиялык активтігі жок заттарға айналады. Алғы заттар тіпті теріс әсер етіп, клеткалардын өсуін тежеп тастауы да мүмкін. Алғы заттардын маңызын аныктау үшін танбалы косылыстарды (изотоптарды) пайдаланып үкыпты зерттеулерді өткізу керек. Ал мүндай жүмыстарды өткізуге басты кедергі болып түрған ол косымша метаболизмдегі өнімдердің биосинтез жолдары жөнінде казіргі танда білімнің жеткіліксіздігі.

Казеин гидролизаты, кокос жаңғағының сүті сияқты күрамы белгісіз органикалык үстемелер ортаға буферлык әсер көрсетеді. Коректік орталардың буферлык сыйымдылығы өте төмен, сондыктан олардын алғашкы рН көрсеткіші (5-6) клеткаларды өсіргенде тез-ак бірнеше бірлікке жылжып кетеді. Сонын аркасында клеткалардын биосинтездік кабілеттері мен өнімдердін жиналуы өзгереді. Корыта айтканда, кажетті өнімді мол шығарудын манызды жолы - үйлесімді коректік ортаны іріктеп алу. Осындай зерттеулердін нәтижесінде өнімділік орталары (продукционные среды) деген коректік орталар аныкталды. Мұндай ортада клеткалар косымша метаболиттерді мол синтездей алады.

Косымша заттардын корлануына әсер ететін физикалык факторларға жарык, температура, газдың күрамы, араластыру тәртібі және ауамен камтамасыздандыру жатады. Өсірген клеткаларда каротиндер, эфир майлары, флавоноидтар, пластохинондар, антоциандар, катехиндер, алкалоидтар, витаминдердің түзілуіне жарык дүрыс әсер еткен. Жарык фенолдар метаболизмнің ферменттерін активтеген, ал көмірсулар мен липидтардын алмасуына ол ыкпал етпеген. Косымша метаболизмге жарыктын сапасы, яғни спектрлік күрамы да әсер етеді. Мысалы, ақжелкен клеткаларына люминесцент жарығын уздіксіз тусіру косымша заттардың жинакталуына тиімді болған. Флавон іликозидтарьшын синтезі толкын үзындығы 320 нм төмен ультракүлгін сәулелеріне және келесі «кызыл-үзынтолкынды кызыл» жарыхка өте сезімтал болған. Бәлкім бүл клеткаларда энергиясы төмен фитохром жүйесі активті болған.

Гашюпаппустың клеткаларында көк сәуленің әсерімен антоциандардын мөлшері арта түскен. Ал кей кезде жарык кері әсер көрсеткен. Мысалы, сасык мендуананын, скополияның, хина ағаштьщ клеткаларында алкалоидтардын, темекі каллустарында никотиннің, торғайшөп клеткаларында шикониннің синтезін тежеген. Бүдан баска да косымша заттардың синтезделуіне жарыктын әсері туралы деректер бар.

Клеткалардын өсуі мен биосинтездеріне температураның әсері жөнінде деректер өте аз. Бүтін өсімдіктерде температура косымша метаболизмге әжептәуір әсер етеді, сондыктан клеткалар денгейінде де мүндай зерттеулер жүргізу кажет. Клеткалардың есуі мен синтездеріне кажет температура бірдей бола бермейді. Мысалы, адыраспан клеткалары 30°С жаксы өскен, ал олардын күрамында алкалоидтар 25°С ең жаксы жинакталған.

Клеткаларда косымша заттардын корлануын, оларда өтіп жаткан биосинтез, биотрансформация және биодеградация процестерінін арасындағы динамикалыктепе-тендіктін нәтижесі деп түсіну керек. Осы процестердін әр қайсысына сырткы және ішкі факторлардын әсері туралы өте күрделі және негізгі білім болмағандыктан, оларды бакылау киынға соғады. Сондыкта^ косымша заттардың жинакталуына әсер ететін факторлардъі зерттегенде эмпирикалык тәсілді колдану амалсыздыктан болыц жүр.2.3. Клеткаларды өсіру жүйелері Клеткалар суспензиясы Клеткаларды іп упго жағдайында өсірген кезде олардын өсуі мен биосинтездеріне өсіретін жүйелердін техникальіқ көрсеткіштерінін манызы өте зор. Өсімдіктердін косымЦ[_а заттарынын биотехнология өндірісі көбінесе сүйык ортада өсетіц клеткаларга негізделген. Лаборатория жағдайында косымц^ метаболизмді зерттеген кезде клеткалар әдеттегідей колбалард_а кішігірім көлемде (40-200 мл) өсіріледі және айналмал^ тербеушілерде араластырылады. Колбалардын айнаііу жылдамдығы (әдетінше минутына 90-120 айналым) клеткалардьің өсуіне және метаболиттердің жинакталуына әсер етеді. Мысал^ итжидек пен үйенкі клеткаларынын айналу жылдамды»_Ь] төмендегенде, олардын өсуі бәсендеген. Ал темекі клеткаларынь)_Н өсуіне айналу жылдамдығы әсер етпеген, тіпті жылдам айналдыр, аркасында оларда никотин синтезі арта түскен.жолы - үйлесімді коректік ортаны іріктеп алу. Осындай зерттеулердін нәтижесінде өнімділік орталары (продукционные среды) деген коректік орталар аныкталды. Мұндай ортада клеткалар косымша метаболиттерді мол синтездей алады.

Косымша заттардын корлануына әсер ететін физикалык факторларға жарык, температура, газдың күрамы, араластыру тәртібі және ауамен камтамасыздандыру жатады. Өсірген клеткаларда каротиндер, эфир майлары, флавоноидтар, пластохинондар, антоциандар, катехиндер, алкалоидтар, витаминдердің түзілуіне жарык дүрыс әсер еткен. Жарык фенолдар метаболизмнің ферменттерін активтеген, ал көмірсулар мен липидтардын алмасуына ол ыкпал етпеген. Косымша метаболизмге жарыктын сапасы, яғни спектрлік күрамы да әсер етеді. Мысалы, ақжелкен клеткаларына люминесцент жарығын уздіксіз тусіру косымша заттардың жинакталуына тиімді болған. Флавон іликозидтарьшын синтезі толкын үзындығы 320 нм төмен ультракүлгін сәулелеріне және келесі «кызыл-үзынтолкынды кызыл» жарыхка өте сезімтал болған. Бәлкім бүл клеткаларда энергиясы төмен фитохром жүйесі активті болған.

Гашюпаппустың клеткаларында көк сәуленің әсерімен антоциандардын мөлшері арта түскен. Ал кей кезде жарык кері әсер көрсеткен. Мысалы, сасык мендуананын, скополияның, хина ағаштьщ клеткаларында алкалоидтардын, темекі каллустарында никотиннің, торғайшөп клеткаларында шикониннің синтезін тежеген. Бүдан баска да косымша заттардың синтезделуіне жарыктын әсері туралы деректер бар.

Клеткалардын өсуі мен биосинтездеріне температураның әсері жөнінде деректер өте аз. Бүтін өсімдіктерде температура косымша метаболизмге әжептәуір әсер етеді, сондыктан клеткалар денгейінде де мүндай зерттеулер жүргізу кажет. Клеткалардың есуі мен синтездеріне кажет температура бірдей бола бермейді. Мысалы, адыраспан клеткалары 30°С жаксы өскен, ал олардын күрамында алкалоидтар 25°С ең жаксы жинакталған.

Клеткаларда косымша заттардын корлануын, оларда өтіп жаткан биосинтез, биотрансформация және биодеградация процестерінін арасындағы динамикалыктепе-тендіктін нәтижесі деп түсіну керек. Осы процестердін әр қайсысына сырткы және ішкі факторлардын әсері туралы өте күрделі және негізгі білім болмағандыктан, оларды бакылау киынға соғады. Сондыкта^ косымша заттардың жинакталуына әсер ететін факторлардъі зерттегенде эмпирикалык тәсілді колдану амалсыздыктан болыц жүр.
Дәріс 6. Жасушаларды өсіру жүйелері. Иммобильденген клеткалар суспензиясы

Клеткаларды іп упго жағдайында өсірген кезде олардын өсуі мен биосинтездеріне өсіретін жүйелердін техникальіқ көрсеткіштерінін манызы өте зор. Өсімдіктердін косымЦ[_а заттарынын биотехнология өндірісі көбінесе сүйык ортада өсетіц клеткаларга негізделген. Лаборатория жағдайында косымц^ метаболизмді зерттеген кезде клеткалар әдеттегідей колбалард_а кішігірім көлемде (40-200 мл) өсіріледі және айналмал^ тербеушілерде араластырылады. Колбалардын айнаііу жылдамдығы (әдетінше минутына 90-120 айналым) клеткалардьің өсуіне және метаболиттердің жинакталуына әсер етеді. Мысал^ итжидек пен үйенкі клеткаларынын айналу жылдамды»_Ь] төмендегенде, олардын өсуі бәсендеген. Ал темекі клеткаларынь)_Н өсуіне айналу жылдамдығы әсер етпеген, тіпті жылдам айналдыр, аркасында оларда никотин синтезі арта түскен. Көлемі шағын колбалардан көп литрлік ферментерлерге канда өсіру көрсеткіштері өзгереді, әсіресе араластыру мен аэрациясы. Клеткалар суспензиясын өндірісте өсіру үшін микроврганизмдерге колданылатын аппараттарды пайдаланады. Бірсонғы зерттеулер көрсеткендей, өсімдік клеткалары өздері өзгешеліктеріне карай ерекше аппараттарды кажет етеді (2-сур) Өсімдік клеткаларының көлемі бактериялар мен санырау күлактарға карағанда 10 есе, тіпті 100 есе ірі келеді, мүныіккатар онтогенезде де олардын көлемі өзгереді. стационарлык фазасында көлемі өсіп вакуолі пайда болады Неғүрлым клетканын көлемі үлкейсе, соғүрлым оның араласт^п

аркасында бүлінуінін кауіптілігі арта түседі. Сонымен келген өсімдік клеткалары ірі және ауыр болған сон оларды жиі араластырып түру кажет. Өйтпесе олар ферментердін түбіне тез картаяды да акырында жойылады.

Сонымен бірге клеткаларды шайып турған коректік ортаньщ өзінен кажетті затты бөліп алу онай емес.

Өндірісте колданылатын иммобильденген клеткаларды өсіру ушін биореактордын бағана тәріздесі колайлы, өйткені мүнда орын үнемделеді және клеткалар аркылы ағып жаткан коректік ортаны бакылау онайланады. Кейбір өсімдіктер клеткалары метаболизм барысында жарыкты кажет етеді.

Иммобильденген клеткалар түрлі заттардың биотрансформа-циясына да колданылуы мүмкін. Иммобильденген клеткалар технологияда үзак уакыт пайдаланылатын болғандыктан, биокатализ процесі арзанға түседі.

А. Альферман кызметтестерімен мынадай тәжірибе өткізген. Олар оймакгүддін (Щ?іт.а1і$ Іапаіа) альгинат гелімен капталған клеткаларын (диаметрі 4-5 мм 50 түйіршік) Эрленмейердін 100 мл-лык колбаларында 25 мл коректік ортада өсірді. Биотранс-формация өтетін субстрат ретінде (Р-метидцигитоксин колданған, ол тәжірибе барысында (р-метилдигоксинге айналған. Субстраты бар коректік орта үш күн сайын алмастырылып түрған. Осындай жағдайда клеткалар 170 тәулік бойы субстраттың биотрансфор-мациясын жүргізіп, оны кажетті өнімге айналдырып түрған. Жүрек ауруын емдеу үшін дигоксин өте тиімді. Бірак, өсімдікте оған карағанда дигитоксиннің мөлшері едәуір артык. Екеуінің химиялык айырмашылығы - дигоксиннің 12-ші көміртек атомында косымша гидроксил тобы бар. Оймакгүлдін каллус клеткаларын биотрансформация реакцияларын өткізу үшін пайдаланып жүректік гликозидтарды өндіруге болады.

Сөйтіп, иммобильденген клеткалардың суспензияда өскен клеткалармен салыстырғанда мынадай артыкшылыктары бар:

♦ биомассаны кайта-кайта үзак уакыт пайдалану (клеткалар биореактор ішінде сактала береді, ал өнімдер коректік ортадан бөлініп алынады);

♦ клеткалардын козғалысы шектелгендіктен, олар коректік ортаға бөлініп шыкпайды, онымен араласпайды;

♦ клеткалардын мол биомассасын сыйымдылығы шамалы ыдыстарда өсіру;

♦ клеткаларды үзак өсіру;

♦ биотрансформация мүмкіншілігі.

Қосымша заттарды алу үшін клеткалык техноло-гияларды дайындау жүмысынын кезендері

1. Экономика жағынан тиімді өсімдікті тандап алу. Өсіруге алынатын өсімдіктерде бағалы, экономика жағынан манызды косымша заттары айтарлыктай жоғары мөлшерде болуы кажет. Эсіресе бүл жағдайдын сирек кездесетін немесе жоғальш бара жаткан өсімдіктерге катысы бар.

2. Іп уііго жағдайына алғашкы енгізу. Ол үшін кажетті зат жоғары мөлшерде синтезделетін жеке өсімдіктер таңдап алынады. Алдымен алғашкы каллустарды катты ортада өсіріп алады.

3. Биомассада косымша заттардын сандык және сапалык күрамына химиялык зерттеу жүргізу. Бөлініп жаткан каллус клеткаларьшда көбінесе косымша заттардын мөлшері бүтін өсімдіктер мүшелеріне қарағанда аз болады. Бүл түтас өсімдікте косымша заттардың синтезі цитодифференцировканың бакылауында болатындығын дәлелдейді.

Іп уііго жағдайында клеткалардың дифференциялануы басылғанда немесе тежелгенде, косымша заттардын биосинтезі төмендеуі мүмкін. Осы жағдайды ескерген жөн. Клетканын генетикалык мүмкіншіліктерінін толык іске аспауына баска себептер де бола алады, мысалы автотрофтык коректенуден айырылу. Сонымен катар, әр түрлі факторлардын ыкпалымен өнімдердің күрамы да өзгере алады. Кейбір өсімдіктерде косымша заттардың метаболизмі өсу процесі бәсендегенде басталады, сондыктан оларға алдымен каркынды өсуге, ал кейін заттардын биосинтезіне лайыкты жағдай жасалады.

Биомассаны нәтижелі химиялык бакылауға алу үшін заттарды аныктайтын жүйрік (экспресс) әдістері керек. Атап өтетін жағдай, баяу өсетін клеткаларда өте төмен концентрациядағы метаболиттерді аныктау өте киын. Сондыктан соңғы кезде каллустарды сүрыптап тез бағалау үшін радиоиммунохимиялык және иммуноферменттік әдістері колданылады. Иммунофер-менттік әдісінін мынадай артыкшылығы бар: талдау тез арада өтеді және оны автоматтандыру мүмкіндігі бар.

4. Үйлесімді коректік орта мен өсіру жағдайларын іріктеу. Косымша метаболизмді белгілейтін генетикалык информация жүзеге асу үшін ерекше жағдайлар керек, Тәжірибеде

колданылатын коректік орта өсірген клеткаларға үйлесімді екеніне толык сенім болмағандыктан, әр жолы коректік ортанын күрамы мен баска факторларды ғылыми әдебиеттегі деректерге сүйене отырып іріктеп алуға тура келеді. Клеткаларды сүйык ортаға көшіріп өсірген кезде, бүл жүмыс одан әрі киындайды, себебі суспензияны өсіргенде аэрация мен араластыру факторларынын әсерін де еске алу кажет.

5. Клеткалардын өнімді штамдарын шығару. Барлык клеткаларда косымша заттарды жоғары мөлшерде шығару өте киын максат. Өйткені, клеткалар үзак уакыт өсіргенде бағалы затты синтездеу кабілетінен айырылады. Клеткалардын түріне тән ерекше заттарды синтездеу кабілетін жоғары денгейде сактау ушін әжептәуір күш жүмсау керек. Ол үшін генетикалык денгейіндегі әрекеттер мен клеткалык сүрыптауды колданады. Клеткалык технологияға негізделген тиімді ірі масштабты өндірісті үйымдастыру үшін гормондарды кажет етпейтін (прототрофтык), коректік ортаны талғамайтын, осмостык және механикалык стрестерге төзімді мутант клеткалары керек.

Іп уііго жағдайында мутант клеткалары мен варианттарды алу кең таральш келеді. Мысалы, жылан раувольфиясы клеткаларына этилениминмен әсер етіп мутагенез жүргізіп, жүрек аритмиясын емдейтін аймалян алкалоидын жоғары мөлшерде синтездейтін клеткалар линиясы алынған. Өсіру жағдайларын жаксарту нәтижесінде, осы линияда аймалин өнімділігі одан әрі өсіп, түтас өсімдікпен салыстырғанда 10 есе арткан. Ал болашақта өнімді штамдарды шығарудын ен тиімді жолы, ол клеткалык және гендік инженерия әдістерін пайдаланып жанадан өте өнімді кажетті клеткаларды күрастыру.

6. Ең жаксы өнімді штамдарды алдымен суспензияда өсіру. Кдтты ортада алғашкы шыккан каллустар сүйык ортаға көшіріледі. Өсіру тәртібі өзгергенде штамм өзінін сапасын жоғалтпауы керек, яғни ол стресс жағдайларына төзімді болу керек. Ерекше киын кезен - клеткаларды лабораториялык тәжірибедегі кішкене колбалардан үлкен ферментерлерге көшіру. Казір биотехнология-лык өндірісте клеткаларды әр түрлі факторлар (температура, газдар күрамы, жарык, кышкылдык, физиологиялык активті заттардың мөлшері) автоматтык реттелетін ферментерлерде өсіреді.

7. Өнімді және түракты штамдарды өндіріс жағдайына жакын,

көлемдері жүйелі кеңейтілетін ферментерлерде өсіру. Егер клетка-лар осындай жартылай өндіріс жағдайында өсу каркындылығын сақтап және кажетті заттың синтезін, жинакталуын және оның ортаға бөлініп шығуын өзгертпесе, бүндай штамды ірі масштабтык өндірісте пайдалануға болады. Штамның бүдан баска манызды касиеті, оның генетикалыктүрактылығы, өзіне тән биологиялык активтілігін сактауы.

8. Клеткалык биомассаны алу және оны бағалаудын техника-лык регламентін (іс тәртібін) жасау. Өндірістік технология тиісті аппаратураны талап етеді. Мысалы, Жапонияда колданылатын көлемі 20000 л ферментерде темекі клеткалары үш ай бойынша үзіліссіз өсіріледі. Сол клеткалар күніне әрбір литрден 5,582 г убихинонды өндіреді. Жапонияда баска косымша заттардын да ірі масштабтык өндірісі іске косылған (2-кесте).

Бүл биотехнологиялык әдістін дағдылы вегетативтік жолмен көбеюмен салыстырғанда бірталай артыкшылыктары бар, атап

айтканда: Көбею коэффициенті өте жоғары. Мысалы, гербера, бүл-дірген, хризантема, раушаннын бір өсімдігінен іп ұігго жағдайыңца бір жылдын ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер алуға болады. Алма ағашынын бір бүршігінен 8 айдын ішінде 60 мыннан астам өркен шығады. Таңкүрайдың бір бүтадағы меристемаларын бөліп алып өсіріп жылына 50 мынға дейін өсімдік алуға болады. Сонымен, микрокөбеюдін коэффициенті баска вегетативтік көбею әдістерімен салыстырғанда мындаған есе артык.

2. Микрокөбеюмен катар өсімдіктер вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауыктырылады.

4. Вегететивтікжолмен көбейе алмайтын өсімдіктерді мысалы,

өнеркәсіп деңгейінде біркатар өсімдіктерді көбейтеді.

5. Үнемділік. Арнайы бөлмеде стеллаждарда орналаскан пробиркаларда жыл бойы мындаған өсімдіктерді өсіру аркылы теплицалар алаңы үнемделеді.

6. Жас өсімдіктерді алу, яғни кәрі дарактарды жасарту.

Микрокөбейту үшін өте оңды каллус клеткалары генетика түрғысынан түракты, сабак апексінің меристема клеткаларына үксас және токтаусыз бөлінуге кабілетті болуы керек. Бүдан баска, бүл каллус көптеген регенерант өсімдіктерін беруге кабілетті болуы керек. Мысалы, темекі мен фрезия каллустары 10 жыл бойына регенеранттарды беріп отырған.

Колайлы жағдайларда каллус жаксы бөліне бастайды, меристемалык аймактары түзеліп буршік немесе эмбриоид пайда болады. Бүршіктен өсіп шыккан өркенді микрокалемшелеу аркасында көбейту коэффициенті едәуір арттырылады. Регенерантты алу ушін өркен міндетті түрде тамырландырылуы кажет.

Үрыкка үксас күрылымдар - эмбриоидтар - бір мезгілде сабак пен тамыр апекстерін түзеді. Каллустын эмбриондык клеткаларына айналып, онан сон эмбриоидтардын түзілуі фитогормондармен реттеледі. Егер маманданбаған каллус клеткалары эмбриогендік клеткаларына айналу үшін ауксин кажет болса, кейіннен эмбриоидтардын дамуына ауксин керек емес. Сондыктан онын концентрациясын төмендетеді немесе тіпті оны коректік ортаға коспайды. Бірак бүл зандылык барлык өсімдіктерге таратылмайды, кейбір түрлерде сомалык эмбриогенезі цитокинин мен гиббереллинді талап етеді.

Каллустан шыккан регенеранттардын генетикалык түракты-лығы күмән туғызады. Себебі, каллусты өсірген кезде полиплоид-тык, анеуплоидтык және баска хромосомалык аберранттык клеткалардын саны өседі. Сондыктан, бастапкы өсімдікпен салыстырғанда одан ауткыған өсімдіктердін пайда болуы ыктимал. Солай болса, микрокөбейту үшін колданылатын каллустын өсу мерзімі өте кыска болуы керек. Тіпті, ең жаксысы, ол ушін алғашкы шыккан каллусты пайдалану. Сонымен катар, тағы бір ескертетін жәйт - үзак өсірген каллус морфогенезге кабілеттілігі-нен айырылады. Әсіресе бүл күбылыс дәнді дакылдарда байка-лады. Ал темекі каллусында морфогенезге кабілеті керісінше, бірнеше жылдап сакталады.

Кдзіргі уакытта өндірісте сомалык үрыктар аркылы өсімдіктерді кобейту аз колданылады. Бүл әдіспен тек орхидея түкымдастары, рута түкымдастары, соның ішінде цитрус түкымдастары, және гвинеялык немесе зәйтүн пальмасы өндіріс масштабында кобейтіледі.

Зәйтүн пальмасы майлы дакылдардың ішінде соядан кейін екінші орынды алады. Бүл пальманың плантациялары 25-28 жылдан кейін жаңартылуы керек. Ол үшін миллиондаған өскіндер кажет. Пальма айкас тозаңданатын осімдік болғандыктан, оның үрығынан тараған үрпактары өзгергіш болады. Сол себептен жоғары өнімді пальманын жана сорттарын түкыммен кобейтуге болмайды. Бүндай жағдайда клондык микрокөбейту әдісі ен колайлы болады. Бірак табиғатта зәйтүн пальмасы өркен және жанама оркендерді түзбейді, яғни бүршік меристема аркылы оны кобейту мүмкін емес. Сондыктан кобейтудің жалғыз жолы, ол каллустан регенеранттарды алу.

Каллустарды ағаштың үшындағы ен жас жапырактардан шығарады. Алғашкы каллусты колайлы коректік ортаға кошіру нәтижесінде оларда эмбриоидтар пайда болады. Эмбриоидтардын санын кобейту үшін тағы баска коректік орта колданылады. Онда эмбриоидтардын саны бір айдын ішінде үш есе кобейеді. Коректік ортаны бір ізді алмастырып отырып эмбриоидтардан өскін шығарып, кейін оларды тамырландырады. Каллусогенезге 3 ай уакыт жүмсалады, одан кейін эмбриоидтар пайда болып, олар өскіндерге жетілгенше тағы үш ай уакыт отеді. Сойтіп 10 эм-бриоидтан бір жылдын ішінде алғашкы өсімдікке үксас 500 мың осімдік алуға болады. Осы әдіс Кот-д'Ивуар Республикасында Ла-Ме тәжірибе станциясында пальманын жоғары майлы сорттарынын ондірістік кобейтуінін негізі етіп алынған.

Арпа мен кара бидай аралык будандарын каллусогенез аркылы кобейтуде жаксы нәтиже алынған. Сонғы жылдары түраралык және туысаралык будандастыруға арпанын бірнеше түрлері кенінен катыстЫрылып жатыр. Соның нәтижесінде арпанын біркатар жаксы будан формалары алынған. Олар селекция үшін оте кажетті, бағалы бастапкы материал бола алады. Бірак арпанын будандарымен айналысканда мынадай киыншылык кездеседі: түкымнын бітімі өте төмен, сондыктан бірлі-жарым түкымнан өсірген будан осімдіктер аз және үрпаксыз болады да, табиғи жолмен көбеймейді. Пісіп жетілмеген жас үрыктарды іп уііго жағдайында өсірсе, пайда болған каллустары жоғары тотипотенттік касиет көрсетеді және оларды мерзімділікпен жана ортаға көшіріп отырса, регенерант өсімдіктерін шығаруға кабілетін бір жылға дейін сактайды.

Осындай сомалык клеткалардан өсіп шыккан регенерант-тардағы хромосомаларының саны зиготадан пайда болған ұрыктан шыккан будандармен бірдей болған. Бұл әрине микрокөбейтудін осы тәсілін колданғанда, генетикалык тұрактылыктын сакталатындығынын белгісі. Сөйтіп, сомалык клеткалардан шыккан каллус үлпаларын астык тұкымдастарды клоңдык көбейту ушін пайдалануға болады.

Сонғы жылдары астык тұкымдастардың бірнеше тұрлерінде сомалык эмбриогенез процесінің өтуі жөнінде морфологиялык және гистологиялыкдәлелдер алынған. Пісіп жетілмеген ұрыктар-ды, жас гүлшоғырларынын және жапырактардын төменгі жағын-дағы кесінділерін Мурасиге-Скугтың коректік ортасында өсіргенде эмбриогендік каллус ұлпалары пайда болады. Осы эмбриогендік каллустарды үзак уакыт өсіруге болады және көптеген эмбриоид-тарды алып отыруға болады. Американ ғалымы И. Васил пікірінше, бұл әдіс астык тұкымдастарын микроклондап көбейту ұшін өте колайлы. Эмбриоидтардан тез уакытта көптеген өсімдік шығады, ол өсімдіктер бір клеткадан өсіп шығады, өйткені бір ғана эмбриогендік клетканын бөлінуі нәтижесінде пайда болады.

Бұдан баска, эмбриоидтан шыккан регенеранттар әрдайым генетикалык тұрактылыкты көрсетеді. Клондык көбейтуде бүл өте манызды жағдай. Сонымен, редифференцияланбаған каллус клеткаларынан регенеранттардын пайда болатын екі жолы да (эмбриоидогенез бен органогенез) өте тиімді және кейбір жағдайларда олар микрокөбейтудін жалғыз ғана жолы болады.

Өсімдіктерді көбейту ушін эмбриоидтарды колданатын тағы бір жол бар - ол жасанды тұкым. Жасанды түкым деп полимер кабығымен капталған эмбриоидтарды атайды. Бірак практикада барлык эмбриоидтарды бірдей даму кезеніне келтіру, яғни оларды синхрондау, өте киын. Көлемі және тығыздығы бірдей эмбриоид-тарды алу үшін оларды тесігі белгілі (400 - 500 мкм) илектен өткізеді немесе сахарозаның тығыздык градиентін әр тұрлі етіп жасап центрифуга аркылы бөліп алады.Қазіргі кезде сәбіздің, жоңышканың, бидайдын, күріштін, балдыркөктін барлығы бірдей белгілі даму кезенінде эмбриоид-тардын жаппай шығарудьщ лабораториялык әдістері дайындалған. Оларды түкым ретінде пайдалану үшін, әр түрлі колайсыз жағдайлардан корғайтын және үзак уакыт өміршендігін сактауға себін тигізетін кабыкшаға салу керек. Кабыкша ретінде натрий альгинат колданылады. Сонымен катар, бүл кабык суды үстап түруы керек және капсуланын ішінде асептикалык жағдайды камтамасыз ету кажет. Мақсатка сәйкес капсуланын ішіне сомалык эмбриоидтын алғашкы дамуына кажет коректік заттарды салуға болады мысалы, көмірсулар мен минералдык түздарды. Әзірше бүндай «түкымды» тек лабораторияларда шамалы мөлшерде ғылыми-зерттеу және селекциялык жүмыстары үшін алады. Ал биотехнологияның максаты оларды өндірісте мол мөлшерде шығару.

Өсімдіктер физиологиясы, генетикасы және биоинженериясы Институтынын клеткалык инженерия лабораториясында Е.С.Сванбаев кызметтестерімен жоңышканың жасанды түкымын алудын технологиясын зерттеп дайындаған (21-сурет). Жоңышканың залалсыздандырылған өскіңдерінің жапырағынын сағағын Гамборгтын агарлы коректік ортасында өсіріп, каллус алынады. Одан кейін каллус Гамборгтың сүйык ортасына көшіріледі. Сонан соң суспензияда сомалык эмбриогенез басталады. Бір апта өткен сон суспензияны тесіктері әркелкі (200-300-400-500 мкм) торлар аркылы өткізіп, көлемі бірдей, яғни даму кезені біркелкі, эмбриоидтар іріктеліп алынады. Алынған эмбриоидтар гормондары жок коректік ортаға көшіріліп, дамуы жалғасады. Ол үшін коректік ортаға абсциз кышкылын енгізу керек, сонда эмбриоидтардың өсуі тежеледі, бірак даму процесі токтамайды. Эмбриоидтардың алғашкы (түкымжарнак) жапырактары өскен сон, оларды эксикаторда бөлменін температурасында кептіріп, кабык түзілуі үшін полимермен өндейді. Полимерді КазМУ-дын химия факультетінін ғылыми кызметкерлері синтездеген.

Клондык микрокөбейту әдістерін сарапка салғанда, мынаны атап өту керек: меристемадан шыккан регенерант өсімдіктері бастапкы өсімдіктерімен генетикалык жағынан біркелкі болған-дыктан, каллус немесе экспланттын маманданған клеткаларынан пайда болған өсімдіктерден едәуір айырмашылыктары болады. Шыккан өсімдіктерде біршама геномдык мутациялар болуы мүмкін.

Каллустан пайда болған өркендерде мутациялары бастапкы кезде көрінбейді, себебі олар жапырактьщ формасына, гүлдердін түсіне, жемістің сапасына байланысты болуы мүмкін. Сондыктан олар кейінірек осімдік пісіп жетілген кезде ғана байкалады. Мысалы, колтык меристемасынан пайда болған аспарагустың регенеранттарында генетикалык ауытқулык байкалмаған, ал каллустан шыккан осімдіктердін 70% полиплоидтык болған. Егерде осімдікті каллус аркылы көбейту қажет болса, ол үшін тек жас мүшелерінен алынған каллусты пайдалану керек.

Сонымен, генетикалык жағынан біркелкі өскіндерді шығарудың ен сенімді жолы, оларды колтык оркендерден алу. Сабактын ұшындағы бүршікті (апексті) іп уііго осіргенде жалғыз өркен түзіледі, мүнымен бірге онын апикальдык басымдылығы болады. Колтык бүршігінен шыккан өркеннен өсімдік шығару өте үзак уакытты және коп енбекті керек кылады, себебі әрдайым оскен оркендерді бөліп алып, оларды тамырландыру керек. Жылдам көбейту каллустағы эмбриоидогенез аркылы өтеді. Цитрустар мен зәйтүн пальмасын көбейту жүмыстары көрсеткендей, бүнда генетикалык түрактылык сакталады. Эмбриоидтарды пайдалану колайлы, сондыктан олардан жасанды түкым шығару технологиясының болашағы зор.! 3.3. Микрокөбейту процесінін кезеңцері Клондық микрокобейту жүмысы 4 этаппен отеді

I ЭТАП. Эксплантты іп упіо жағдайында өсіру. Бүл кезде толығымен залалсызданған эксплантты алып, лайыкты коректік ортаға отырғызьш, оның жаксы осуіне колайлы жағдай туғызу керек. Бүл этаптын нәтижелілігі эксплантты дүрыс тандап алуға байланысты. Ол үшін донор есімдіктің әр даму кезеңінде үлпаларынан немесе мүшелерінен экспланттар алынып, олардын іп үііго жағдайында осу және морфогенездік кабілеттері зерттеледі.

II ЭТАП. Микрокөбейту. Өркендердің пайда болуы және олардын санын көбейту.

Ш ЭТАП. Өркендерді тамырландыру және оларды сактау. Жаксы тамыр жүйесі пайда болуына және дамуына жағдай туғызу. Ол үшін коректік ортаға ризогендік факторы, яғни ауксин косылады. Тамырлар осіп жетілген сон өсімдіктерді топыракқа көшіруге дайындайды немесе салкын жерге кояды. Төмен температура осімдіктердің дамуын тежеп, үзак уакыт сактауға мүмкіншілік береді. Олар іп уііго жағдайында жаксы өседі және тотипотенттігі жоғары болады.

Негізінде кез келген өсімдіктің түрі белгілі тәсілдерді колданса, каллустан да регенерант бере алады. Эксплант алынатын өсімдік неғүрлым жас болса, соғүрлым одан шықкан каллустын регенерацияға кабілеті жоғары болады. Ювенильдік кезеңдегі өсімдіктерден, яғни өскіндерден алынған каллустың морфогендік потенциалы ен жоғары болады. Экспланттын физиологиялык жасы каллуста өтетін морфогенез жолына да әсер етеді. Мысалы, Есһеуегіа еіеёапз жас жапырағының экспланттарынан өскен каллустарда көбінесе тамырлар пайда болған, қартайған жапырактарынан - өркендер, ал орта жастағы жапырактан -тамырлар мен өркеңдер пайда болған.

Микрокөбейту үшін эксплант алынатын мүшенін де маңызы зор. Сонымен катар, экспланттын морфогеңдік кабілетіне онын көлемі ықпал етеді. Неғүрлым эксплант кішкене болса, соғүрлым онын органогенезге кабілеті төмендейді. Ірі экспланттардын генетикалык түрактылығы артады., бірак бүл кезде олардын клеткаларында вирустар сакталып калуы мүмкін. Сондыктан практикада эксплантгын орташа көлемін іріктеп алады.

Микрокөбейту технологиясында коректік ортаның орны ерекше, әрбір өсімдік түрі үшін оның қүрамы тәжірибеге сүйеніп іріктеледі. Ең жиі колданылатын Мурасиге мен Скугтын ортасы каллустың пайда болуына және оның өсуіне лайыкты, яғни микрокөбейтудің I этапына ынғайлы. Егерде микрокөбейту колтык бүршіктерін өсіру аркылы өткізілсе, каллустын пайда болуы үнамсыз қүбылыс. Сондыктан бүл әдіске каллус түзілуін тежейтін баска коректік орталары колайлы келеді. Микрокөбейту-дін [ этапында коректік ортаға антиоксиданттар жиі косылады, олар гидролиз өткізетін ферменттердің активтелуін тежейді, деме.к эксплантты сактап калады. Антиоксидант ретінде цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, аскорбин кышкылы колданылады. Тіпті эксплантты отырғызу алдында оларды осы заттардын ерітіңдісімен жуады.

Көптеген өсімдіктер айтарлыктай мөлшерде фенолдык заттарды синтездейді, олардың тотығуы салдарынан үлпалар қарайып, өсуі тежеледі. Бүл заттардан күтылу жолдары, ол каллустарды жиі-жиі жаңа ортаға көшіріп отыру немесе коректік ортаға оларды өздеріне адсорбциялайтын заттарды косу, атап айткандаң активтелген көмір, поливинилпирролидон т.с.с. Эксплантты өсіре бастағанда және көбейтуді өткізгенде коректік ортанын күрамы күрделі болады, ал тамырландыру үшін коректік ортадағы заттардын саны да, мөлшері де азайтылады. Мысалы, Уайт ортасының минералдык негізі немесе сүйылтылған Мурасиге мен Скуг ортасы ауксиндермен (ризогенездін индукторлары) толықтырылады. Кей кезде тамырландыруға ынталандыру үшін ауксинді ортаға коспай өркендердін өздерін онымен өндейді. Бүл тәсіл ағаштар мен бүталарды микрокөбейткенде жаксы нәтиже береді. Бүл жағдайда каллус аз түзіліп тамырлар тезірек шығады.

Ен жауапты кезен, ол IV этап - өсімдіктерді топыракка отырғызу. Кейде тамыр түтіктері жаксырак өссін деп, өсімдіктерді сүйық ортаға отырғызады. Бір аптадан кейін оларды автоклавтан өткізілген топырак коспасына көшіреді. Ылғалдықты жоғары деңгейде сактау үшін, үстінен шыны ыдыстармен жабады (7-10 күн). Ылғалдылығы жоғары арнайы камерада да өсіреді. Бірак бүл күрделі процедуранын барлык өсімдіктерге кажеті жок. Мысалы, картоп, бүлдірген, танкүрай, карақат, алма, шие, мамыргүл т.б. өсімдіктерді пробиркадан стерильденген (тіпті стерильденбеген де) топырак, шым тезек және күмнан жасалған субстратка көшіруге болады, кейін олар теплицада өсіріледі.

Физикалык факторлардын ішінде ен маныздылары жарыК пен температура. Морфогенез процестеріне өте жарык жағдайлардын керегі жок: 1000-3000 лк 14-16 сағат фотопериоды жетіп жатады. Өсімдіктерді толыракка көшіруге дайындағанда оларға 10000 лк жарык түсіріп баулиды. Көптеген өсімдіктерге ен жаксы температура шамамен 25°С. Бірак әрбір түрдің табиғатта температураға талабын еске алу керек. Мысалы, пиязшыкты өсімдіктер үшін табиғатта ен жаксы температура 18°С болса, монстера үшін - 30°С болады.

Гп уііго жағдайында күңды өсімдіктерді алу үшін су алмасудын манызы зор. Өсімдіктерде су алмасуы бүзылғанда витрификация деген жағымсыз күбылыс орын алады. Витрификация (витра -әйнек) кезінде өсімдік клеткалары ісінеді, сабактары жуандайды, жапырактары үзарып, майысып, суланып, әйнек тәрізді болып кетеді. Бүл морфологиялык өзгерістерге коса жапырактардын күрғак массасы төмендейді, белок, хлорофилл, целлюлоза, лигнин.