№1 Зертханалық жұмыс (2 сағат) Тақырыбы

№ 1 Зертханалық жұмыс (2 сағат)

Тақырыбы:  Бөлмелерді,   өсімдік   материалдарды,   ыдыстарды,   инструменттерді

және қоректік орталарды зарасыздандыру. Маткалық ерітінділерді дайындау.

Жұмыстың   мақсаты:  Бөлмелерді,   өсімдік   материалдарын,   ыдыстарды,

инструментерді,   қоректік   орталарды   зарасыздандыру   техникасын   білу   және   жасанды

қоректік орта үшін маткалық ерітінділерді дайындау әдістемелерін білу.    

 

Теория

Жекеленген   мүшелерді,   ұлпаларды,   жасушаларды   және   протопластарды   сәтті

өсірудің   негізгі   шарттардың   бірі   қатал   зарасыздандыруды     сақтау.   Жасанды   өсіруге

арналған қоректік орталарда өсімдік ұлпаларда, жасушаларда микроорганизмдер жақсы

дамиды   да   өсірілетін   материалға   қауіп   туғызып   жатады,   сондықтан   да   мұқият

зарасыздандыру   өте   қажет.   Организмдердің   тіршілік   әрекеті   нәтижесінде   қоректік

орталардың   құрамы   өзгереді.   Одан   басқа   жкелеленген   ұлпалар   мен   жасушалар

протопластар   ерекше   тез   микроорганизмдермен   зақымданады.   Сондықтан   да   барлық

зертханалық   жұмыстар   жекелеген   мүшелер,   жасушаларн   мен   ұлпалар   және   өсімдік

протопластары     бойынша     ламинар   –   бокстарда   өткізіледі.   Жұмысқа   қажетті   барлық

материалдар,   мақта   пробкалары,   қоректік   орталар,   өсімдік   материалдар,   ыдыстар,

инструменттерді және боксты зарасыздандырылады. 

Зертханалық   жұмыстың   техникалық   жабдықтандырылуы   мен   құрал   –

жабдықтары.        Тұқымдар,   түйнектер,   бұталар,   өсімдік   сабақтары.   500   –   700   мл-лік

химиялық   стакандар,   1   литрлік   колбадағы     тазартылған   дистилленген   су,   скальпелдер,

пинцеттер, инелер, заттық шынылар, стерилизаторлар, пробиркалар, қоректік ортасы бар

шыны ыдыстар, суық зарасыздандыруға арналған «Миллипор» немесе Зейц фильтерлары.

Автоклав, сушильдік шкаф. 

Зертханалық жұмысты орындау тәртібі мен мазмұны

Ламинар – бокс. Ламинардың жұмыс кеңестігін  70 % - ды спиртпен сүрту керек. Содан

кейін   ламинарға   спирттік   горелканы,   сіріңкелерді,   96   %   -   ды   спирті   бар   ыдыс,

зарасыздандырылған   су   мен   инструменттер,   зарасыздандырылған   суы   бар   колба.

Меристеманы   бөліп   алу   жұмысы   кезінде   ланинарға   бинокулярлы   үлкейіткіш   әйнек

қояды.Ламинар   боксты   бактеридцидты   ультрокүлгін   лампалармен   10   –   12   сағат   бойы

сәулелендіреді.

Ыдыстар.  Зарасыздандыру   сушильдік   шкафта   немесе   автоклавта   жасалынады.

Ыдыстарды жуу үшін детергенттерді және сонымен қатар серная (      ) қышқылы бар 2

хромқышқыл   калий   (хромпик)   пайдалынады.     Пробиркалар   мен   колбаларды

зарасыздандыру алдында мақтамен тығындап жауып, қаптама қағазға орайды. Одан кейін

ыдыстарды кептіргіш (сушильный) шкафқа салып + 175 С температурада 2 сағат бойы

қыздырады.     Осындай   қыздыруда   бактериялар   ғана   емес   сондай   –   ақ   споралар   өледі.

Сушильный   шкафта   +   175   С   температурадан   жоғары   болмау   керек,   себебі   мақталық

пробиркалар қарайып, ал қағаз шашылып кетеді.  

Автоклафта қысым арқылы қатал зарасыздандыру өткізуге болады,  себебі ылғалды

ыстық микроорганизмдер мен олардың спораларын құрғақ ыстыққа қарағанда тиімдірек

өлтіреді. Автоклавтан қақпағы бар стакандар, Петри ыдыстары, пипеткалар, тазартылған

суы  бар колбалар сияқты заттар өткізуге  болады. Ыдыстарды фольгаға немесе қаптама

қағазға орап, 2 атм   автоклавтан 25 – 30 минут бойы өткізеді. Пипеткалардың жоғарғы

бөлігін мақтамен жауып, пипеткаларды 10 данаман қағазға орайды.  

Құрал – саймандар.  Алғашқы құрал – саймандардың, яғни пинцет, скальпель т.с.с.

заттардың   залаласыздандыру   жұмысын   кептіргіш   шкафта   (сушильный)   ыстық   құрғақ

бумен   12   сағат   бойы   140   С   температурамен   істейді.   Қайнаумен   шприцтерді

залалсыздандыруға   ыңғайлы.   Металл   заттарды   автоклав   арқылы   залалсыздандыруға

болмайды, себебі олар будың әсерімен тот басып жарамсыз болады.  Отырғызуды бастау

алдында   құрал   –   саймандарды   форфор   стаканға   батырып   96%   -   ды   этил   спиртімен

қосымша залалсыздандырады және спиртовканың жалынында ұстап қүйдіреді. Күйдіруге

ланцеттерді, пинцеттерді, микробиологиялық петляларды болады. Залалсыздандырған соң

құрал   –   сайман   заттарды   алдын   ала   залаласыздандырған   қағаздарға   орап   салады.

Залалсыздандырған затты тек қана бір манипуляция жасау үшін қолданады. Одан кейін

оны таға да спиртпен залалсыздандырып болған соң және отпен қүйдіріп алады. Жіңішке

ұсақ заттарды (инелер, лезвиялар) қүйдіру кезінде өзінің қасиетін жоғалтады сондықтан

оларды спиртте салып залалсыздандырады.  

Материалдар.  Ұлпаларды отырғызу кезінде қолданылатын заттарды мысалы мақта,

марля, мақта тығындарды фильтр қағазды, халаттарды автоклавта 2 атм. қысымда 25 – 30

минут бойы залалсыздандырылады.  

Өсіру материалдары. Тұқымдарды, өсімдіктің кез келген жерінен алынған ұлпаларды

залалсыздандыру   үшін   алуан   түрлі   залалсыздандырғаш   ерітінділерді   қолданады:

сулеманың сулы  ерітінділерін немесе 2 хлор сынап (0,1%), (1%) бром, пергидроль  (20-

30%),  хлорамин (3-6%), диацид, гипохлорит натрийі (10%).

Диацидті   былай   жасайды:   жеке   330   мг  этанолмеркурхлорид  пен   660   мг

цетилпиридинилхлоридті   ыстық   суда   шамамен   (300   мл)   ерітеді,   алған   ерінділерді

араластырып  көлемін   1 литр   дистилденген  сумен  және  таға  бірнеше  тамшы  детергент

Твин-80 қосып жеткізеді. 

Өсімдік   ұлпаларды   залалсыздандыру   алдында   оны   тазартады.   Өсімдіктердің   жуан

тамырларын,   түйнектерді   өте   жақсы   жылу   сумен   шеткамен   және   сабынмен   жуады.

Тамарлардан   қабығын   алады   да   дистилденген   суда   жуып   бірнеше   секундқа

абсолютыспиртке салады.  Негізгі залалсыздандаратын ерітіндінің әсерін спирт күшейтеді.

Залалсыздандырған   соң   өсімдік   объектілерін   жақсылап   залалсыздандырғыш   заттардан

жуып дистилденген суда шаяды.  

Диацидтті   кукурузаның   астық   ржи   залалсыздандыруға   пайдалануға,ал   пергидроль

фасоль,   люпин,   күнбағысқа,   томат   және   т.б.   залалсыздандыруға   жақсы.   Диацидпен

тұқымды 15 -20 минут, ал пергидролмен 10 минут залалсыздандыру ауқыт алады. 

Қоректік   орталар.    Қоректік   орталары   бар   колбалар   мен   пробиркаларды   мақта

тығындармен   тығындап   жауып,   аузын   целлофан   намесе   қаптама   қағазбен   жауып

автоклавта 120 С температурада 1 атм қысымда 20 мин бойы жұмыс жасайды.  

Суық   залалсыздандыру.   Қыздыруға   төзіп   алмайтын   органикалық   сұйықтарды

бактерииялардан   тазартуды   залалсыздандырғаш   ұсақ   поралы   0,45   мкм   болатын

бактериалды фильтрден өткізеді. 

Зертханалық жұмыстың есеп беру талаптары 

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша 

көрсетілу керек. 

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі 

кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет 

салуға болады. 

Зертханалық жұмыстың орындалу тәртібі

1.  Биотехнология   зертханасында   жұмыс   істейтін   барлық   студенттер   қауіпсіздік

техника ережелерімен танысу керек. 

2. Ыдыстарды детергент ерінділерде мұқият жуу (кір жуу ұнтағы,сабынды су).

3.Детергенттерден 8 – 10 рет жуу

4.   Хромпикке   4   –   6   сағатқа   салып,   10   рет   жылы   сумен   жуып,   одан   кейін   5

дистелденген сумен рет шайып алу. 

5. Таза ыдысты 2 сағат бойы 130-170°С кептіргіш шкафқа (сушильный шкаф) қояды. 

6.  Металл   құрал   –   саймандарды   өте   тығыз   орап   қағазға   салып,  170-200°С

температурада 2 сағат бойы құрғақ ыстықпен заласыздандырады. 

7.  Құрғақ  ыдыстарды,  құрал заттарды  целлофан немесе  қағазға  орап  зертханалық

сүрмелерде сақталуы тиіс. 

8.  Мурасиге-Скуга қоректік орта үшін маточный ерітіндіні дайындау. Ең алдымен

макро-,   микроэлементтердің   және   дәрумендерді   маточный   ерітінділерін   жасау   тиіс.

Мурасиге   және   Скуга   орталарға   мынадай   құрамды   маточный   ерітіндін   жасаймыз:  -

NH

4

NO

3

, KNO

3

, KH

2

PO

4

, MgSO

4  

.

7H

2

O (MgSO

4

 

.

  7H

2

O  соңғы  құяды  қыздырусыз  соңғы

құяды ол тұмбаның түсуін алдын алады. 

-  CaCl

2

 ерітіндісі;

-  темір  хелат  ерітіндісі  (  FeSO

4

  ерітіндісі және  ЭДТА-Na

2

,  темір  хелат  түзілу үшін

қайнағанша қыздыру керек.); 

- микроэлементтер ерітнділері 

Маточный ерітіндіні дайындау үшін тұз мөлшерін, сонымен қатар қоректік ортаны

дайындау үшін  қажетті  маточный  ерітіндінің  мөлшерін  келтірілген  1 таблицада  көруге

болады. 

Алған   ерітінділерді   шыны   ыдыстарда   жабылатын   пробкасы   және   этикеткасы   бар

тоңазытқыштарда сақтайды. Темір хелатын қараңғы шыныда сақтайды.   

          Концентірленген дәрумендер ерітінділерін флакондарда тоңазытқыштарда сақтайды.

1 мл бұл ерітіндіде 1 литр Мурасиге – Скуганың ерітіндіге қажетті мөлшерде дәрумен

болады. 

Мурасиге – Скуга бойынша маточный ерітінділердің құрамы 1 кесте

Қоректік ортаның компоненттері                  г/л маточный ерітінді

Макротұздар                                      

КNO

3

                                                                          38

CaCl

2   

(безводный)                                                   8,8 

NH

4

NO

3

                                                                     33

или CaCl

2

 

.

 2H

2

O                                                      13,8

MgSO

4 

(безводный)                                                  3,6

или MgSO

4

 

.

7H

2

O                                                     7,4

KH

2

PO

4

                                                                     3,4

На 1 л среды брать по 50мл маточного раствора

Микроэлементы                                         мг/100 мл маточный ерітінді

H

3

PO

4

                                                                       620

MnSO

4

 

.

 4H

2

O                                                          2230

ZnSO

4

                                                                       860

Kl                                                                              83

Na

2

MoCl

4

 

.

 2H

2

O                                                      25

CuSO

4

 

.

 5H

2

O                                                           2,5

CoCl

2

 

.

 6H

2

O                                                            2,5

1 л ге орта үшін 1 мл маточный ерітінді алу керек 

Fe-хелат                                                       мг/100 мл маточный ерітінді

FeSO

4

  

.

7H

2

O                                                           557

ЭДТА-Na

2 

(трилон Б)                                             745

1 л ге орта үшін 5 мл маточный ерітінді алу керек 

Бақылау сұрақтары :

1. Залалсыздандыру дегеніміз не?

2. Ыдыстарды, құрал – саймандарды қалай залалсыздандырады?

3.Өсімдік объектілерін қандай әдістермен залалсыздандырады?

№ 2 Зертханалық жұмыс (2 сағат)

Тақырыбы:  Мурасиге   –   Скуганың   сұйық   және   агарланған   қоректік   ортаны

дайындау .

Жұмыстың мақсаты: Мурасиге – Скуга ортаның негізінде шоғырланған ұлпалар

мен жасушаларды өсіру үшін қоректік орталарды дайындау. 

Теория

Шоғырланған   жасушалар   мен   ұлпаларды   өсіруге   арналған   қоректік   орталарда

өсімдіктерге   қажетті   барлық   макроэлементтер,   дәрумендер,   көмірсулар,   фитогормондар

болуы тиіс. Кейбір қоректік орталарда гидролизат казеині мен белгілі бір аминқышқылдар

болады. Осыдан басқа қорктік орталардың құрамына  ЭДТА   (этилендиаминтетрасірке

қышқылы)   немесе   оның   натрий   тұзы   жасушаларға   темірді   жеткізуге   белгілі   бір   рН

болады. Шоғырланған ұлпалар мен жасушаларды өсіру кезінде қоректік орталарда қажетті

компоненттің   бірі   көмірсулар   болып   саналады,   себебі   олар   автотрофты   қоректенуге

қабілетсіз болады.  Әдетте көмірсулар көзі ретінде сахароза немесе глюкозаны 20 – 40 г/л

концентрациясында   қолданады.   Жасушалар   дифференциясы   және   жасушалық   бөліну

индукциялары үшін өсу реттеушілер қажет. Сондықтан да калустық ұлпаларды алу үшін

қоректік  орталардың  құрамына жасушаның  дедифференцировканы  тудыратын  аусиндер

мен цитокиндер кіруі керек. 

Әдетте   қоректік   орталарда   ауксиндердің   көзі   ретінде   2,4   дихлрфиноксисірке

қышқылын (2,4-Д), 1 – 10 мг/л; индолилсірке қышқылын (ИСҚ) (ИУК) 1 – 30мг/л және

нафтилсірке қышқылын (НСҚ) – 0,1 – 2 мг/лпайдалынады (ИСҚ) 2,4 Д қарағанда 30 есе

аздау   болады.   Каллус   пайда   болу   индукциясына   әдетте   ауксиндердің   жоғары

концентрациясын   пайдаланады,   ал   кейінгі   көшіріліп   отырғызу   кезінде   ұлпа   өседі   де

ортадағы ауксиндердің құрамы бірнеше есе азайтлады. 

Жасанды   қоректіе   қоспаларда   цитокиндердің   көзі   ретінде   кинетин   6   –

бензилалинопурин (6-БАП),зеатин (0,001 – 10 мг/л) кинетинге қарағанда зеатин мен БАП

шоғырланған   ұлпалардың   өсуін   және   органогенез   индукциясын   реттеуде   белсендірек

болады. Кейбір қорктік қоспалардың құрамына аденин кіреді. 

Жеке қоректік орталарда ауксин мен цитокиндерден басқа гибберел қышқылы да (ГҚ)

болады. Кейбір жағдайларда қорктік орталарға өсімдік экстрактылары мен шырындарын

қосады.   Өсуін   ең   белсендіргіш   қасиеттке   кокос   мен   сұйық   кокос   жаңғағының   сұйық

эндоспермі ие

Қатты   қоректік   орталарды   дайындау   үшін   теңіз   балдырлардан   алатын   агар   –   агар

полисарид пайдалынады. Әдетте қатты қоректік қоспаны алу үшін ортаға 5 – 8 % қосады. 

Макротұздардың  микротұздардың және дәрумендердің  ерітінділерін концентрленген

түрде дайындау ыңғайлы. Маточный ерітінділерді тоңазытқышта, ал дәрумендерді теріс

температурада сақтау керек. 

Макротұздардың   ерітінділерін   10  –  20  есе   концентірленген,   микротұздардың   100  –

1000 есе болса, ал дәрумендердің ерітінділері 1000 есе концентрленген болып дайындау

керек. 

Жасушаларды,   ұлпаларды   және   өсімдіктердің   белгілі   бір   мүшелерін   өсіру   үшін

қоректік орталардың әр түрлі құрамын қолданады. 

1, 2 кестедегі Мурасиге – Скуганың 3,4 .

Зертханалық жұмыстың техникалық жабдықтандырылуы мен құрал – 

жабдықтары.

Негізгі   маткалық   ерітінділердің   макро   және   микроэлементтері,   дәрумендер,

фитогормондар, глицин, мезоноинозит, сахароза, агар (кесте 1)

50 – 1000 мл – лік химиялық стакандар және колбалар, негізгі маткалық ерітінделірді

сақтау үшін 1 л пен 100 мл қақпаы тығындап жабылатын банкалар, 20 – 50 мл банкалар, 1

–   25   мл-   лік   өлшеуіш   пипеткалар,   магниттік   араластырғыш   зат,   су   банясы,   автоклав,

аналитикалық таразы, электроплитка. 

Зертханалық жұмыстың орындалу тәртібі

1. Макро және микроэлементтердің негізгі маткалық ерітінділерді, дәрумендерді, 

өсу реттегіштерді дайындау. 

2. Мөлшері 1 л стаканға 1 л ортаны дайындау үшін питеткамен қажетті шығатын 

ерінділердің мөлшерін тасымалдау.  

3. Көп мөлшерде емес дистилденген суды еріту (әрбіреуін жеке) мезо – инозит, 

глицин,   сахароза   және   алынған   ерітінділерді   негізгі   маткалық   ерітіндідегі   стакандарға

енгізу.

4. Алынған сұйық қоректік ортаны стақаннан өлшеуіш цилиндарға құйып мөлшерін

950 мл дейін дистилденген сумен жеткізу. 

5. Қажетті    pH  – қа жеткізу.  Егер pH қажетті көрсеткіштен жоғары болса бірнеше

тамшы 1 H HCI, ал егер төмен болса бірнеше тамшы 1H NaON (KOH) өлшеуіш

цилиндірге қосып жақсылап шайқаңыз. Ортаның біраз мөлшерін стаканға құйып

pH анықтаңыз. Қажеттті көрсеткішке жеткенше pH өлшеңіз. 

6. 6 -7 г пластинкалық агарды ортасы бар стақанға құйып, плитқада қыздыра отырып

еріту қатты қыздыруға жеткізбеу. 

7.   Қоректік ортаны 50 -60 С дейін қыздырып, агардық ыстық ерітіндімен біріктіру.

Ұнтақ тәрізді агарды тікелей ортаға қосуға болады. 

8. Ортаның мөлшерін жылы дистилденген сумен 1 л – ге дейін жеткізіп, жақсылап

араластырыңыз. 

9. Дайын қоректік ортаны 1/ 4 мөлшермен пробиркаларға құып, пробиркаларды мақта

немесе фольга тығындысымен жауып, металл штативтерге пробиркаларды қою. 

10. Штативтерді   автоклавқа   қойып   15   мин   бойы   0,7   –   1   атм   қысымда   автоклавтау

керек. 

Зертханалық жұмыстың есеп беру талаптары 

Зертханалық жазбаларды әдемі, кезеңімен жасалған жұмыстың тәртібі бойынша 

көрсетілу керек. 

Зертханалық жұмыстың барысында қажетті барлық тақырыпты, мақсаттарын, негізгі

кезеңдерін, нәтижелерін тезис, кесте немесе график ретінде жазу керек, тағы да сурет 

салуға болады. 

 Бақылау сұрақтары :

1. Жекелеген жасушалар мен ұлпаларда қоректік орталардың құрамы қандай?

2 Қоректік орталарда ауксиедер ретінде қандай заттар қолданады?

3.Маткалық ерітінділер дегеніміз не және оларды қалай дайындайды?