8.1.2. Соединения с модифицированным углеводным остатком
Наиболее мощными ингибиторами (в том числе терминаторами) биоситеза ДНК являются соединения с модифицированным сахарным остатком. Из 4 асимметричных атомов углерода принципиально важны для проявления субстратных свойств замещения у атомов С2’ и C3’. Примером служит различие в субстратных свойствах между dNTP и NTP: присутствие гидроксила при С2’ в рибо-конфигурации делает NTP субстратами РНК-полимеразы, а замещение гидроксила на протон – субстратами ДНК-полимеразы.
Среди первых субстратных ингибиторов, которые были применены для изучения биосинтеза ДНК, были araNTP и ddNTP (рис. 8.3). Вместо рибозы в состав araNTP входит арабиноза. Все четыре araNTP широко используются для анализа биосинтеза ДНК, главным образом у эукариот. Наиболее эффективно они подавляют синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами α и δ млекопитающих и вирусными обратными транскриптазами. Слабее araNTP действуют на синтез с участием ДНК-полимераз β и еще слабее – с ДНК-полимеразами γ, хотя ингибирование проявляется для всех эукариотических ДНК-полимераз. Очень эффективно действуют araNTP на биосинтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами, кодируемыми вирусами (например, вирусом простого герпеса типа I).
а б
Рис. 8.3. AraNTP и ddNTP.
Молекулярный механизм действия araNTP заключается в том, что они выступают конкурентами dNTP в реакции включения в З'-конец цепи. Будучи включенными в З'-конец цепи ДНК в форме монофосфатов, они не останавливают дальнейший синтез ДНК, хотя сильно замедляют его. В результате мононуклеотидные остатки araNMP находят в цепях ДНК с частотой 10-5 -10-3, причем чаще других они включаются в ДНК, если синтез ДНК катализируется ДНК-полимеразами вирусов или ревертазами.
Эффекты araNTP в ДНК-полимеризующих системах бактерий менее выражены. Вероятно, это обусловлено сильной 3'-5'-экзонуклеазной корректирующей активностью ДНК-полимераз. В клетках E. coli наиболее подвержен ингибированию синтез, катализируемый ДНК-полимеразой III, наименее – ДНК-полимеразой I.
Другая большая группа ингибиторов синтеза ДНК in vitro включает ddNTP (рис. 8.3). При синтезе ДНК, катализируемом ДНК-полимеразой I E. coli, ddNTP конкурируют с природными субстратами dNTP специфично к основанию и включаются в растущую цепь ДНК. Далее, из-за отсутствия реакционноспособной группы в 3'-положении, последующее удлинение цепи прекращается. Включившись в цепь ДНК, нуклеотидный остаток, не содержащий гидроксила в 3'-положении, выщепляется 3'-5'-экзонуклеазной активностью в 1000 раз медленнее, чем природный нуклеотидный остаток, что и определяет возможность использования ddNTP как терминаторов.
Было показано, что ddNTP терминируют синтез ДНК, катализируемый ревертазами разного происхождения и ДНК-полимеразой β. ddNTP оказались эффективными ингибиторами синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами III E. coli, полимеразами аденовирусов, вируса герпеса, митохондриальными ДНК-полимеразами и др. В то же время синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами α млекопитающих, почти не ингибируется ddNTP. ДНК-полимеразы не взаимодействуют с ddNTP, не узнают их.
Совместно с araNTP ddNTP широко используются для классификации ферментов эукариот (наряду с другими тестами). Кроме того, dNTP являются хорошими терминаторными субстратами для концевых дезоксинуклеотидилтрансфераз, включаются в 3'-конец и используются для 3'-мечения олигонуклеотидов.
В 1984 г. синтезированы и изучены 3'-амино-3'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты dNTP(3'NH2). Эти соединения оказались эффективными терминаторами синтеза, ката лизируемого ДНК-полимеразами I Е. соli, α из тимуса теленка, β из печени крыс, ревертазой, кодируемой вирусом птичьего миелобластоза, а также концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой. dNTP(3'NH2) не терминировали синтез, катализируемый лишь одной из испытанных ДНК-полимераз, а именно ферментом, кодируемым фагом Т4.
Аналоги dNTP, содержащие в З'-положении азидогруппу dNTP(3'N3), эффективно подавляют синтез ДНК, катализируемый обратными транскриптазами, в том числе действуют на ревертазу ВИЧ. Этот ингибитор действует селективно на обратную транскриптазу, не ингибируя ДНК-полимеразы α и β человека.
Ингибиторными и терминаторными свойствами обладал аналог dGTP, не содержащий С2' и C3'-атомов (ацикловир-ТР)
а б
Рис. 8.6. а - dNTP(3'F), б - ацикловир-ТР (R=H) и ацикло GTP (R=CH20H)
Это соединение оказалось селективным ингибитором синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой вируса простого герпеса. Ацикловир-ТР включается в форме монофосфата в З'-конец растущей цепи ДНК и терминирует дальнейший синтез. Еще более мощным ингибитором и терминатором роста цепи ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами вируса простого герпеса типов I и II, оказался ацикло-GTP. Оба эти соединения были селективными ингибиторами ДНК-полимераз вирусов герпеса на фоне ДНК-полимераз клеток хозяина. Ацикловир-ТР способен инактивировать ДНК-полимеразы вирусов герпеса после включения в цепь ДНК в форме ацикловир-МР.
Поскольку репликативный синтез ДНК инициируется РНК-полимеразными активностями (РНК-полимеразами, праймазами), одна из возможностей ингибирования репликации заключается в воздействии на синтез рибо-праймеров. Найдены высокоспецифичные ингибиторы синтеза рибо-праймеров in vitro – 2'-азидо-2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты [NTP(2'N3)]. Так, АТР(2'N3) ингибировал праймазную активность в бесклеточных системах из E. coli и ряда опухолей.
Достарыңызбен бөлісу: |
