Рабочая методика Реакция торможения гемагглютинации для тестирования сывороток Подготовка сывороток, антигенов и эритроцитов Подготовка сывороток

Рабочая методика
Реакция торможения гемагглютинации для тестирования
сывороток
Подготовка сывороток, антигенов и эритроцитов
Подготовка сывороток
Сыворотки крови животных и людей содержат различные полисахариды,
включающие сиаловые кислоты, которые могут прикрепляться к гемагглютинину вируса
гриппа и затруднять связывание специфических в отношении гриппа
гемагглютинирующих антител. Для удаления этих неспецифических ингибиторов
гемагглютинации образцы сыворотки обрабатываются ферментом, разрушающим
рецептор (RDE).
1. Быстро разморозьте исследуемые сыворотки крови при +37 °C на водяной бане. Сразу
после разморозки поместите сыворотки в лед и держите на льду во время использования.
2. Добавьте 40 мкл образца сыворотки в пробирку.
3. Добавьте 120 мкл RDE в каждую пробирку.
4. Закройте пробирки пробками.
5. Выдерживайте на водяной бане при +37 °C от 18 до 20 часов.
6. Затем поместите пробирки в водяную баню при +56 °C на 30 минут.
7. Добавьте 240 мкл ФСБ, pH = 7,2 в каждую пробирку. Конечное разведение сыворотки
имеет соотношение 1 : 10. Конечный объем ≈ 400 мкл.
8. Оставьте на ночь при +4 °C. Если необходимо более долгое хранение, заморозьте до –
20 °C или ниже.
Подготовка эритроцитов
1. Аккуратно наберите, используя пипетку объемом 10 мл, примерно 5 мл эритроцитов со
дна колбы. Профильтруйте через стерильную хлопковую марлевую салфетку в
коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
2. Осторожно наполните коническую пробирку холодным ФСБ, закройте пробкой и слегка
перемешайте, переворачивая пробирку.
3. Центрифугируйте при 1200 об./мин в течение 10 минут при +4 °C.
4. Удалите надосадочную жидкость, используя пипетку объемом 10 мл. Будьте
внимательны: не всколыхните осадок эритроцитов.

5. С осторожностью повторите промывку холодным ФСБ (пункты 2–4) еще два раза, чтобы
всего было три промывки эритроцитов. Для предотвращения гемолиза всегда бережно
обращайтесь с эритроцитами, держите ФСБ на льду при температуре +4 °C и не
промывайте эритроциты больше трех раз.
6. Удалите оставшийся супеpнатант при помощи микропипетки и храните уплотненные
эритроциты на льду.
7. Приготовьте раствор суспензии эритроцитов 1 : 100. Для этого добавьте 100 мкл
эритроцитов к 9,9 мл холодного ФСБ в конической пробирке объемом 15 мл. Осторожно
перемешайте, переворачивая пробирку.