Бактерия плазмидалары және рекомбинанттық ДНҚ құрастыру

Векторлар ретінде көбінесе ішек таяқшасы E.coli және де басқа бактериялардың плазмидалары қолданылады. Бактерияларда басты хромосомадан басқа көптеген кішкентай сақина тәрізді болып тұйықталған қос тізбекті ДНҚ молекулалары кездеседі. Сақина сияқты ДНҚ молекулалары бір-біріне оралып күрделі спираль құрайды. Плазмидалар өз бетіне репликациялана алатын ДНҚ молекулалары. Олар бактерияның басты хромосомасымен тіркеспеген, жасуша ішінде өз алдына еркін орналасқан. Плазмида құрамында тетрациклин немесе канамицин сияқты антибиотиктерге төтеп беруді қамтамасыз ететін ферменттердің гендері бар. Плазмидаларды хромосомалық ДНҚ-дан бөлекше таза түрінде алуға болады.

Өсімдік шаруашылығында сорттар жиі алмастырылып тұруы қажет. Ол жағдай бірнеше себептерге байланысты: біраз мерзімнен соң сорттардың кейбір құнды белгілері біртіндеп жоғала бастайды, ауру қоздырушы микрорганизмдер мен зиянкес жәндіктердің өте қауіпті жаңа популяциялары пайда болады да, оларға төтеп беру қиынға соғады, климат өзгереді, топырақтың құнарлығы төмендейді және тағы да көптеген жағдайлар. Мысалы, бидай және басқа астық ьұқымдастарының сорттары шаруашылықта пайдаланатын орташа мерзімі әдетте 5-10 жыл болады. жаңа сорттарды шығару үшін және ескі сорттарды жақсарту үшін әр алуан бағалы генетикалық материалдар қажет. Сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан түрлердің генофондын және селекция үшін бағалы объектілер мен штамдарды сақтау үшін in vitro жағдайында гендер қорын жасау жөнінде зерттеулер өткізілуде.

Гендердің негізгі көзі ол ұрық, бірақ соңғы кезде биотехнология әдістері дамып, селекцияда қоданыла бастаған соң, генетикалық материал in vitro өсірілетін жасушалар мен ұлпалар түрінде қажет болып жатыр. Гендерді in vitro сақтау әдісі әдеттегі жағдайда ұрықтары сақталмайтын өсімдіктерге қолайлы, вегетативтік жолмен көбейетін және табиғатта жоғалып бара жатқан түрлер үшін лайықты. Құнды заттарды беретін жаңа жасушалар линияларын жасау үшін эталон жасушалары бола алатын жасушалар коллекцияларын да сақтау керек. Сонымен, бірталай теориялық және рактикалық мәселелерді шешуге жасушаларды шешеуге сақтаудың ыңғайлы әдістері қажет екені сөзсіз.

Көптеген жылдар бойы бастапқы жасушаларды сақтау мақсатымен оларды үзіліссіз ең қолайлы жағдайда өсіруді қолданды. Бірақ мұнда жасушаларда генетикалық өзгерістер өрістеуі ықтимал. Сонымен қатар, бұ еңбек пен қаражат көп жұмсалатын жұмыс. Өсірілетін жасушаларды сақтаудың екі жолы бар: олардың өсуінг барынша бәсеңдету немесе оларды мұздатып сақтау-криосақтау.

Бұл тәсілдің міндеті, жасушалардың өсу кинетикасын өзгерту, жаңа қоректік ортаға көшіру уақыт аралығын барынша созу, мысалы 3-4 айға, тіпті бір жылға дейін. Қазір белгілі факторлардың әсерімен өсуді бәсеңдету өркендер мен регенеранттарға қолданылады.

Өсуді бәсеңдету үшін ең әрекетті жол температура мен жарықты төмендету. Температура өсімдіктің суыққа төзімділігіне қарап іріктеліп алынады. Мысалы, картоп жасушаларынң коллекциясын сақтағанда температура 10°С, ал алма үшін 1°С болады. әдетте 20°-25°С температурада өсетін жасушаларға 4°-10°С, ал 30°С өсетін жасушаларға 15-20°С температура қолайлы.

Өсімдіктердің өсуін сонымен қатар қоректік ортаға қосылған кейбір заттар тежейді. Мысалы, маннит пен сорбит осмотиктер ретінде, сахароза жоғары концентрацияда және өсуді тежейтін арнайы заттар. Өсуді тежеу үшін гипоксияны да қолданады, яғни оттегін азайтады. Гипоксияны туғызу үшін 90% азот пен 10% оттегі қоспасын пайдаланады. Кедй оттегі концентрациясымен бірге сарқылмау және сорғымау үшін оның көлемін ұлғайтады. Сұйық орта қолданылғанда, оған оқтын-оқытн қоректік заттар қосылып тұрады.

Температура баяу төмендесе, жасушаның бос суы жарым-жартылай сыртқа шығып үлгереді де, сыртқы ерітіндіде мұзға айналады. Ал мұздату өте жедел өтсе, жасушаның дегидратациясы жүріп үлгенмейді де, мұз цитоплазма ішінде түзіле бастайды. Бәсең мұздатқанда жасуша ішінде мұз кристалары пайда болуы мүмкін, бірақ бұнда жасушаның едәуір сорғуымен протоплазманың соғылысуы болмай қалмайды. Протоплазманың сорғылуы, мұз түзілу салдарынан сыртқы ерітіндінің концентрациясы өсу себебінен болады. шектен тыс плазмолиз және соның нәтижесінде пайда болатын осмостық стресс жасушаны зақымдайды.

Сонымен мұздатқанда жасушаның құруының себебі, ол ішінде мұз түзіліп оның мембраналары механикалық қиратылуы. Демек, криосақтау әдісінде қолданылатын тәсілдердің міндеті, осы екі факторлардың зиян әсерін төмендету. Жасушалардың тірі қалуы көптеген факторларға байланысты. Олар: генетикалық және морфофизиологиялық ерекшеліктері; суыққа шынықтыруға қабілеті; түрлі криопротекторлардың құрамы мен мөлшері; осы заттар мен судың жасушаға сіңу деңгейі; температураны төмендету жылдамдығы; еріту жағдайлары. Жасушаларды мұздатып сақтау жұмысының этаптары:

• 
  жасушаларды дайындау;
  
• 
  криопротекторды қосу;
  
• 
  бағдарламалы мұздату;
  
• 
  сұйық азотта сақтау;
  
• 
  тез еріту;
  
• 
  криопротекторлы кетіру;
  
• 
  қайтадан өсіру және регенеранттарды алу;
  

Өте төмен температура жағдайында жасушаларды, меристемаларды, өркен апекстерін, ұрықты, тозаңды сақтауға болады. бірақ осындай әр түрлі объектілерді криосақтау үшін бірнеше тәсілдер мен жағдайлар қажет.

Осы әдіс жасушалар суспензиясы үшін жете зерттеліп дайындалған. Ірі, вакуольденген жасушаларға қарағанда мұздатуға майда, меристема тәрізді жасушалар төзімді келеді. Құрылымдары күрделі меристемалар, ұрықтар, эмбриоидтарға мұздату кездегі әрбір этапьтың жағдайларын ерекше бақылау қажет.

Жасушалар суспензиясын мұздатуға дайындағанда меристема тәрізді жасушаларды неғұрлым көбейту керек. Оған жету үшін жасушаларды осмотик қосып ұзақ өсіру, жасушалардың бөлінуін барынша синхрондау және жаңа қоректік ортаға жиі көшіріп отыру керек. Сонда жасушалардың көлемі кішірейіп, олардың көбі тірі қалады. Жасушалардың тіршілікке икемділігі кейбір амин қышқылдарды қосып өсіргенде, ішінде қант мөлшері өсу нәтижесінде арта түседі. Жасушалар суспензиясын дайындағанда өте бір маңызды жәйт, оның концентрациясын көтеру, яғни оны қойылту. Мысалы, сәбіз жасушаларының суспензиядағы тығвздығын 2-3 есе арттырғанда, олардың тіршілікке қабілеттілігі едәуір өскен. Мұздатуға дайындау талаптары әр түрлі жасушаларға жеке эксперимент бойынша іріктеліп алынады.

ДМСО жасушаға өте жақсы енеді, бұл ірі тығыз құрылымдарға, мысалы меристема үшін өте маңызды. Оларды мұздатуға дайындағанда ортаға 5 % ДМСО қосып өсіреді. Бұлкезде апекс бойында (ұзындығы 0,3-0,5 мм) тиімді қорғайтын ДМСО концентрациясы пайда болады. мысалы, дәрілік түймедағы жасушаларын алдын ала ДМСО қосқан ортада өсіріп, кейін мұздатқанда ДМСО, глицерин және сахароза қоспасын бергенде, жақсы нәтижеге жеткен. Жасушаларды мұздатып сақтау мәселелерін көптен бері зерттеп жүрген А.С.Попов көрсеткендей, бірқатар өсімдік жасушалар суспензияларын нәтижелі қор,ау үшін криопротекторлардың қоспаларын және криопротекторлар мен осмотиктер қоспаларының әр түрлі концентрациясын пайдалану қажет.

Ең ыңғайлы мұздату бағдарламасын тандап алудың маңызы зор. Мұздату баяу, бірте-бірте, жылдам, өте тез, лезде өткізіледі. Баяу біртіндеп мұздатқанда температура 0°С-тан -40°С арасында минутына 0,5°-1°С төмендейді. Жылдам мздатқанда оюъект криопротектор қосылған ампуласымен шапшаң сұйық азотқа салынады. Ал өте тез мұздатқанда объектінің өзі сұйық азотқа лезде салынады. Тозаңды құрғақ түрінде арнаулы пластмасса ампулаларға бітеп жапсырып сұйық азотқа салады.

Мәскеудегі ИФР-де криобанктің деректері бойынша, бағдарламалы мұздату жақсы нәтиже берген. Бұл үшін арнаулы қондырғыш қажет, оның камерасына бағдарламаланған жылдамдықпен сұйық азоттың буы беріліп тұрады. Басқа түрлі мұздатқышта жасушлара балқу температурасы төмен сұйық зат құйылған камераға салынады. Ол камера электрмұздатқышпен суытылып тұрады. Ең қарапайым аспаптар, ол Дьюар ыдыстары мен пенопластан жасалғар қораптар. Лабораториялық мұздатқыштар (-20°С) мен құрғақ мұзы (-78°С) бар камералар жасушаларды сақтауға жарамайды, себебі оларда жасуша ішінде мұз пайда болуын бақылау мүкін емес.

2.Зертханалық сабақтардың жоспары

Зертханалық сабақтар.

1.Өсімдік жасушаларын өсірудің қысқаша тарихы.

Өсімдік жасушаларын өсіру әдістері.

1. Жасушаларды өсіру үшін қандай жағдайлар қажет?

2. Қоректік ортаның құрамына қандай заттар кіреді?

3. Өсімдікті заласыздандыратын заттар.

Жасушаларды өсіруге қажетті жағдайлармен танысу. Ыдыстырды залалсыздандыру. Факторостатты бөлмемен танысу.

Жасушаларды өсіру үшін қандай жағдайлар қажет.
4. Жасанды қоректік ортада өсірілетін жасушаларды өсімдіктер биотехнологиясының теориялық мәселелерін зерттеу үшін пайдалану.

Жасанды қоректік ортада өсірілетін жасушаларды өсімдіктер биотехнологиясының теориялық мәселелерін зерттеу үшін пайдалануды зерттеу.

Жасушаларды өсіру жүйелерімен танысу.

Жасушалар суспензиясы. Иммобильденген жасушалар.Қосымша заттарды алу үшін жасушалық технологияларды дайындау жұмысының кезендері.

1. 
   Өсірілетін жасушалардан экономикалық маңызды қандай заттар алынады.
   

Өсімдіктерді клондық микрокөбейту әдісімен және кезендерімен танысу.

Қолтық бүршіктерінің дамуын қоздыру. Қосалқы өркендердің экспланттан тікелей пайда болуы.Регенерант өсімдіктерден каллустың пайда болуы. Микрокөбейту процессінің кезендері. Өсімдіктердің клондық микрокөбейуіне әсер ететін факторлар. Клондық микрокөбейту әдісін қолдану және келешегі

Сұрақтар: 1. Клондық микрокөбетудің артықшылығы.2. Жасанды тұқым деген не? 3. Клондық микрокөбейту әдісін қолдану қандай кезендерде ұтымды?

Өсімдіктерді сауықтырумен таныстыру.

Апикальдық меристеманы өсіру. Вирус жұққан өсімдіктерді айқындау. Картоптың вируссыз көшетін алу.

Сұрақтар: 1. Өсімдіктердің вирустық ауруларын анықтау әдістері. 2. Вирустық ауруы бар өсімдікті неліктен жылумен өңдейді? 3. Вирустан аластатылған көшеттерді қалай көбейтеді.

Сомалық будандастыру әдістерін зерттеу.

Сомалық будандастыруды сүрыптап алу әдістері. Будан өсімдліктерді талдау әдістері. Сомалық будандарды практикада пайдалану.

Сомалық будандарды биохимиялық талдау әдістері

Жыныстық будандастырумен салыстырғанда сомалық будандастырудың артықшылығы. 3. Будан жасушалар мен будан өсімдіктер қалай сұрыпталады?
10.11. Жасушалық селекция әдістері.

Жасушалық селекция мәселелерін зерттеу.

Жасушалық селекция әдістері. Төзімді жасушаларды сұрыптау. Төзімділік белгісінің тұрақтылығы. Индукцияланған мутагенез. Сомаклондық варианттар. Сомаклондық өзгергіштіктін себептері. Сомаклондық өзгергіштікке әсерететін факторлар.

Жасушалық селекция деген не және артықшылығы? 2. Жасушалық селекция әдістері. 3. Қажетті белгісі бар жасушаларды қалай сұрыптап алады? 4. Жасушалардың мутагенезін қалай индукциялайды?

Сомаклондық варианттар. Сомаклондық өзгергіштіктін себептері. Сомаклондық өзгергіштікке әсерететін факторлар.

Гендік инженерия мәселелерін зерттеу.

Басқа организмге тасымалданатын қажетті генді бөліп алу. Гендерді тасымалдайтын векторлар. Бактерия плазмидалары мен рекомбинанттық ДНК құрастыру.

Сұрақтар.1. Гендік инженерия деген не? 2.Гендік инженерия қалай іске асырылады? 3. Рекомбинантты ДНК деген не, қалай жасалады?

Гендік инженерия мәселелерін зерттеу.

Агробактерия плазмидаларын вектор ретінде қолдану. Хлоропластық және митохондриялық ДНК вектор ретінде қолдану. Жылжымалы генетикалық элементтерді вектор ретінде қолдану. Вирустарды вектор ретінде қолдану.

Сұрақтар: 1. Вектор деген не және оған сай талаптар? 2. Қандай генетикалық құрылымдар вектор бола алады? 3. Агробактериялардың плазмидалары неліктен ыңғайлы вектор бола алады?

Гендік инженерия мәселелерін зерттеу.

Гендерді өсімдіктерге тасымалдау әдістері. Гендік инженерияның

мүмкіндіктері мен даму болашағы.

Сұрақтар: 1. Бөтен гендерді өсімдік жасушасына қалай енгізеді? 2. Өсімдіктер ген инженериясының жетістіктері. 3. Өсімдіктер ген инженериясының келешегі.

3.Емтихан сұрақтары

1.Өсімдітер биотехнологиясы. Мақсаты және міндеттері

2.in vitro ұрықтандыру

3.Қоректік орталар.

4.Биотехнологияның салалары.

5. in vitro эндоспермасын өсіру

6.Гербицидтерге төзімді өсімдіктерді өсіру.

7.Өсімдік жасушаларын жасанды ортада өсірудің қысқаша тарихы

8.Гаплдоидтық технология.

9. in vitro генофондын сақтау

10. in vitro жағдайында өсімдік жасушаларын өсіру әдістері.

11.Тозаңқаптар мен тозаңдарды жасанды ортада өсіріп гаплоидтар алу.

12.Өсімдіктер биотехнологиясының жетістіктері және дамуы.

13.Жасушаларды һөсіруге қажетті жағдайлар.

14Өсімдіктер селекциясындағы гаплоидтардың маңызы

15.Гендерді тасымалдауға қажетті векторлар

16.Каллусты алу және оны жасанды ортада өсіру

17.Жасушалық инженерия

18.Жасушаларды иммобилдеу әдістері

19.Жасушаларды сұйық қоректік орталады өсіру

20.ПРотопластарды бөліп алу

21.Ауруларға және зиянкестерге төзімді өсімдіктерді өсіру

22.Жасушалардың суспензиялық жасанды ортада өсіру

23. in vitro пртопластарын жасанжы ортада өсіру

24.Мобильді генетикалық элементтерді вектор ретінде қолдану

25.Суспензионды жасушаларды алу әдістері

26.Протопластарды жасанды жолмен өсіру барысындағы өсімдіктер регенерациясы

27.Агробактериялар плазмидаларын вектор ретінде өсімдікте қолдану

28.Дедифференциация және каллустың түзілуі

29.Сомалық будандастыру

30.Жасушалық инженерияның мүмкіндіктері және даму перспективасы

31.Жасанды ортада өсірілген жасушаларды гетерогенділігі

32.Дифференциалану, морфогенез және генерация

33.Белоктардың сапасын жақсарту

34.Апикальды меристеманы жасанды ортада өсіру

35.Срмалық будандастыруды практикада қолдану

36.Гендік инженерияның мүмкіндітері мен даму перспективасы

37. in vitro жасушаларын биотехнологияда қолдану

38.Жасушалық селекция

39. Вирустар вектор ретінде

40.Биосинтездік өндірісте жасушаларды қолдану.

41.Жасушалық селекцияның әдістерің

42.Рестриктазалар

43.Қосымша метаболиттердің жиналуына әсер етуші факторлар. Өсімдік генотипі.

44.Төзімді жасушаларды іріктеу

45.Векторларға қойылатын талаптар

46.Жасушаларды жасанды ортада өсіру жүйелері. Иммобильденген жасушалар

47.Индукцияланған мутагенез

48.Рекомбинантты ДНҚ-ның пайда болуы

49.Өсімдіктердің клондық микрокөбеюі

50.Тотипотенттілік

51.Өсімдіктерді клондық микрокөбейтудің маңызы

52.Гендік инженерия

53.Постгамдық сәйкессіздік

54.Клондық микрокөбейтудің әдістері

55.Басқа организмге көшіруге арналған гендерді алу

56.Прогамдық сәйкессіздік

57.Микрокөбеюдің этаптары